Мы публикуем текст лекции канд. биолог. наук, заведующего лабораторией вирусов микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Андрея Летарова "Лечение бактериофагами с точки зрения микробной экологии", прочитанной 7 апреля 2011 года в Политехническом музее в рамках проекта «Публичные лекции Полит.ру».
«Публичные лекции "Полит.ру"» проводятся при поддержке:
Текст лекции
Уважаемые коллеги, исходно я пытался назвать эту лекцию так «Экология бактериофагов, туманные контуры фаговой терапии», но редактор попросил сделать название более популярным, и отсюда родилась фраза «Лечение бактериофагами с точки зрения микробной экологии». В целом это более или менее эквивалентные выражения, хотя первое мне нравится больше. В качестве эпиграфа я взял цитату из недавней публикации по поводу фаговой терапии, я переведу: может, не все тут читают по-английски, она звучит так: «Многочисленные фаговые препараты продаются в наше время в российских аптеках, однако ни клинические испытания, проведенные с этими продуктами, ни фаги, которые в них содержатся, не были описаны в детальных научных публикациях». Эта удивительная ситуация требует своего объяснения и, конечно же, разрешения - а особенно, если мы учтем, что фаговая терапия бактериальных инфекций, то есть попытки лечить заболевания, вызванные бактериями, с помощью вирусов, которые эти бактерии поражают, исторически является первой технологией специфической антибактериальной терапии. Первый опыт по фаговой терапии был осуществлен за несколько лет до начала применения первых сульфаниламидных препаратов.
На слайде мы с вами видим два портрета людей, которые делят честь открытия бактериофагов. Надо сказать, что Фридрих Уильям Туорт опубликовал свое сообщение, которое называлось «Исследование ультрамикроскопического вируса» в журнале «Ланцет» на два года раньше, но в тот момент, хотя вирусы уже были открыты, на самом деле никто не понимал, что это такое, и Туорт в своих рассуждениях постеснялся назвать открытый им феномен вирусом, рассуждая, что, возможно, это – всего лишь фермент, имеющий способность размножаться. С нашей точки зрения, это одно и то же. С точки зрения тогдашней науки не было должной ясности – или, скажем так, не было называния вещей своими именами и поэтому работа Туорта не имела продолжения, отчасти этому помешала Первая мировая война.
Феликс д’Эрель описал фагов дизентерийных бактерий в 1917 году. Это был канадский микробиолог, однако в то время он работал в институте Пастера в Париже. Он в этот момент занимался исследованием причин вспышки дизентерии в кавалерийском эскадроне, расквартированном неподалеку от Парижа. Он выделял от больных культуры и, поскольку он предполагал, что, возможно, дизентерия вызывается одновременной инфекцией каким-то вирусом и бактерией, он смешивал культуры с экстрактами фекалий, профильтрованными через очень тонкий фарфоровый фильтр, который задерживал бактерии. И в какой-то момент эти культуры растворились, лизировались, и д”Эрель сразу почему-то понял, что он имеет дело с вирусом, который поражает бактерии, и назвал его бактериофагом. Этим термином, кстати, не слишком удачным, мы пользуемся по сей день. В отличие от Фредерика Туорта, д’Эрель остаток своей жизни посвятил работе с фагами, сделал очень много, приложил руку к открытию ныне здравствующего института, занимающегося фаговой терапией в Тбилиси, тогда это был Советский Союз, даже собирался переехать жить в Тбилиси. Но вскоре уехал оттуда, поскольку в процессе известных событий 30-х годов его сотрудник Элиава, в честь которого сейчас назван институт, был расстрелян, и д’Эрель счел за благо немедленно вернуться в Париж. В 1917 году выходит его первая публикация по бактериофагам, в 1921 году появляется довольно объемная книга, которая была переведена в 1926 году на русский язык. У меня есть это очень интересное издание, в котором мы видим уже очень большой объем знаний о биологии этих вирусов, накопленных одним человеком, может быть, с помощью лаборанта, с которым он работал. И он же практически сразу пытается использовать бактериофаги для борьбы с инфекциями в 1919 году, то есть через два года после открытия самого феномена, под руководством профессора Гутинеля в детском госпитале в Париже они проводят первый эксперимент по лечению дизентерии. Кстати, этому эксперименту предшествовали своеобразные тесты безопасности, несколько наивные по нашим меркам: фаг выпили сам д’Эрель и его сотрудники в дозах больших, чем они планировали использовать. Тогда такая процедура считалась вполне надежной. Этот опыт был успешным, и Д’Эрель провел еще довольно много исследований в области фаговой терапии. Он лечил, таким образом, дизентерию, некоторые заболевания кур, холеру в Индии и даже несколько случаев чумы. Местами ему сопутствовал значительный успех, он был по-современному мыслящий ученый и ставил довольно аккуратные контроли. Технологии двойного слепого медицинского исследования тогда не существовало, но с точки зрения обычной (не медицинской) научной практики он выполнял довольно аккуратные исследования. И под влиянием его работ поднялась большая волна работ по фаговой терапии, которая активно развивалась до 30-х годов, и многие компании начали выпускать коммерческие препараты бактериофагов - так же, как мы это видим и в наши дни. Что интересно, первая компания, во всей видимости была «Общество безопасных красок для волос», которая дошла до наших дней под именем компании L’Oreal. К 30-м годам накопились проблемы, связанные с тем, что результаты фаговой терапии плохо воспроизводились, и с появлением антибиотиков на Западе от нее отказались, а в некоторых других странах, в частности, в Советском Союзе, а также несколько позже эти исследования были начаты в Польше и Чехословакии. Эта работа продолжалась, продолжается, и по сей день и сейчас есть две страны, где фаги можно купить в аптеке – это Грузия и Россия, и еще есть польский центр, где эти препараты производятся и применяются в лечении как экспериментальная терапия. Однако, в те времена помимо прикладных исследований феномен «бактериофагия» привлек довольно большое внимание исследователей, и отчасти этим обязаны демонстрации того, что бактериофаг представляет собой некий дискретный агент. Если мы возьмем сильно разведенную суспензию этого вируса так, чтобы в некой капле, которую мы можем реально накапать, было, скажем, порядка сотни частиц, и нанесем это на чашку Петри с питательной средой, на которую вместе с вирусом помещаем очень много бактерий так, чтобы они выросли сплошным слоем (этот серый слой - это так называемый газон чувствительной культуры), то там, куда попадают вирусные частицы, мы видим образование дырок. Для сравнения я привел две чашки. Это один и тот же бактериофаг. Этот является мутантом этого варианта. Сама по себе морфология этих дырок, так называемых бляшек, может отличаться, но это дает возможность понять две вещи: что, во-первых, этот агент дискретный, то есть имеется какая-то одна частица, которая куда-то попадает, что-то делает с бактериями и размножается. Можно эту бляшку отсюда вырезать и убедиться, что там очень много фага. И второй момент: мы можем их посчитать и с учетом разведений прикинуть, сколько этих частиц было в исходном материале, и таким образом мы можем мерить их концентрацию. Используя эксперименты, основанные на таких техниках, д’Эрель, а потом и несколько исследователей, среди которых мне бы хотелось назвать Макса Дельбрюка, установили принципы жизненного цикла бактериофагов. Я сейчас о них расскажу, но, что очень важно к этому моменту, это уже 40-е годы, возникает некая потребность науки разобраться в природе наследственной информации. И Макс Дельбрюк, а также еще несколько ученых правильно решили, что бактериофаг - это некоторый пакет, как мы сейчас бы сказали, содержащий определенную генетическую программу. То есть это выделенная самой природой в отдельном виде какая-то упаковка с генетическим материалом, природу которого можно установить, и, кроме того, эта программа развивается очень мощно, то есть в течение 20 минут бактерия практически останавливает свой собственный обмен веществ и делает внутри себя огромное количество вирусов. Это не какое-то небольшое изменение свойств, например, есть у нее там жгутики или нет, это кардинальная перестройка всего обмена с очень большими эффектами, которые легко заметить. И люди поняли, что это модель, которая может привести к успеху, и поэтому исследования фагов легли в основу современной молекулярной биологии, и этот мейнстрим фактически отодвинул в сторону все исследования по экологии этих вирусов до довольно недавних лет, хотя очень неплохие зачатки этих исследований мы находим ещё в работе Дереля. Так развивалась научная мода! Экологию можно было исследовать с полным успехом еще тогда, для этого не было никаких технических препятствий, но научная мода, некие идеи, владеющие довольно небольшой горсткой биологов, работавших в те годы в этой области (их было сильно меньше, чем сейчас), определили развитие науки.
Теперь я позволю себе сделать небольшой краткий экскурс в то, как устроен жизненный цикл бактериофагов. Этот мультик сделан несколько грубо, но дает нам различить несколько стадий так называемого литического цикла. Первая стадия - это прикрепление бактериофага, который узнает определенные молекулы на поверхности клетки. Это так называемый рецептор, он прикрепился и ввел в клетку свой генетический материал. На этом рисунке это был этот самый червячок. Сейчас мультик повторится, и мы это увидим поаккуратнее. На самом деле молекула ДНК, конечно, значительно длиннее бактериофага, но надо понимать, что есть некоторые художественные условности. Вот он прикрепился, узнал свой рецептор, происходят некие события, различающиеся в зависимости от типа бактериофага, которые в итоге приводят к введению внутрь клетки генетического материала, а сам фаг остается на поверхности. Вот этот материал. Те фаги, которые нас интересуют в контексте терапии, содержат только ДНК в качестве генетического материала, ДНК размножается внутри клетки, синтезируются компоненты фаговых частиц, они собираются - и после этого специальные ферменты разрушают оболочку клетки, и она разлетается на мелкие кусочки, высвобождая фаговое потомство. Это мы называем литическим циклом. В нем выделяется период от момента адсорбции фага на клетки до момента лизиса клетки, который называется латентным периодом. В этот момент если мы будем смотреть на количество инфекционных центров в культуре, то их число не изменяется, поскольку фаги инфицировали клетку – естественно, каждая инфицированная клетка пока представляет собой одну единую частицу, и размножения мы не видим. Потом проходит время - и довольно резко мы видим взрывообразный выход фага, его сразу становится много, и мы говорим: латентный период кончился. В пределах этого латентного периода принято говорить еще об эклипс-периоде, это время с момента инфекции, но до того этапа, когда в клетке появятся первые готовые вирусные частицы. Если мы в этот момент клетку бактерии убьем, то фаг погибнет вместе с ней, если мы ее убьем аккуратно хлороформом позже, то уже готовые фаговые частицы смогут выйти, и мы можем увидеть их активность. Вот такая схема событий, так называемый литический цикл и составляет основу размножения бактериофагов. Несколько позже литического цикла был описан вариант, который называется лизогенный цикл, отличающийся тем, что некоторые фаги, так называемые умеренные, могут после введения своей ДНК не размножаться сразу, а в некотором небольшом проценте клеток встраивать свою ДНК в геном бактерии - или не встраивать, она может существовать в цитоплазме отдельной молекулой, плазмидой. И получаются так называемые лизогенные клетки, сейчас мы это увидим, которые живут достаточно долго, делятся, размножаются, и фаговый геном внутри них существует в так называемом выключенном состоянии. В какой-то момент может произойти индукция профага, то есть под воздействием какого-нибудь события или просто случайно эта ДНК активируется, вырезается из генома и вступает на литический путь. Фаги, умеющие делать такое, называются умеренными фагами, а те, которые размножаются только в литическом цикле, называются вирулентными. Это не очень удачный термин, но так уж повелось - и поэтому я должен сразу сказать, что в фаговой терапии по современным стандартам принято использовать только вирулентные фаги, использование умеренных фагов крайне нежелательно по ряду причин, и из-за недостатка времени я сейчас не буду на них подробно останавливаться. Среди них, например, иммунность лизогенных бактерий повторному заражению этих же фагов, а также способность многих умеренных фагов приносить в клетки какие-то гены, которые изменяют их свойства, улучшая выживаемость, то есть можно с помощью умеренного фага сделать бактерию еще более патогенной, поэтому умеренные фаги в фаговой терапии запрещены, а все, о чем мы будем говорить, - это фаги вирулентные, которые размножаются только в литическом цикле.
Итак, адсорбировались, ввели в ДНК, сделали фаговые частицы, клетка лизируется через определенное регулируемое фагом время – во и весь литический цикл.
Пока шли работы по выяснению работы жизненного цикла, во всяком случае - литического, появились первые электронные микроскопы, фирма Siemens начала их продавать, по-моему, с 1939 года, и в начале 40-х появились первые электронные микрофотографии бактериофагов. Одна из них приведена на рисунке, и дальнейшее развитие этой техники к нашим дням позволило сделать очень подробные реконструкции внешнего вида и молекулярного устройства бактериофагов. Здесь представлены представители трех основных семейств так называемых хвостатых фагов, tailed phages по-английски, которые используются в фаговой терапии. Существует еще полтора десятка семейств не хвостатых фагов, но они нас сейчас не очень интересуют, потому что в природе они составляют некое меньшинство, не больше 5%, и в фаговой терапии не используются. Хвостатые фаги бывают с коротким хвостом, они называются Podoviridae, с длинным хвостом - Siphoviridae и с длинным хвостом, способным к сокращению, которые называются Myoviridae. Эстетика этих вирусов, похожих на какие-то космические аппараты, вдохновила многих фантазеров-художников, есть небольшая галерея рисунков, к сожалению, здесь слишком много света, чтобы увидеть фоновый рисунок. Кстати, интересно, что эта фотография на недавнем российском конкурсе заняла какое-то место в конкурсе научной иллюстрации, несмотря на то, что в ней допущена грубая ошибка: у этого фага 8 ножек, длинных фибрилл, а их должно быть 6 - это существенная ошибка, поскольку симметрия этих частиц - это очень важный эволюционный момент. Однако прогресс молекулярной биологии мы пока оставляем за бортом, для это потребуется читать еще одну лекцию, а может, и не одну - чтобы рассказать о том, как все устроено и работает.
Остановимся подробнее на экологии фагов. Что же происходит в природе? До самого конца XX века считалось, что в естественных средах фагов немного, но под занавес века, в 1989 году, появились исследования, где были применены прямые методы наблюдения, то есть их не пытались выращивать, а просто взяли воду из моря, сконцентрировали ее с помощью специальной центрифуги и посмотрели в электронный микроскоп. И выяснилось, что подавляющее большинство вирусных частиц, в основном представляли собой бактериофаги, а не вирусы эукариот, очень много. Некоторые из них изображены стрелочками разного размера, а эти штуки – бактерии, и в большинстве образцов воды количество вирусных частиц в 2-10 раз больше, чем количество бактерий, то есть неожиданно выяснилось, что бактериофаг - это наиболее широко распространенная сущность в природе. Можно даже было увидеть уже инфицированных бактерий, забитых внутри бактериофагами и, посчитав их количество, оценить вклад фагов в смертность бактерий водных систем, и оказалось, что они убивают от 15 до 70% в зависимости от условий среды – в любом случае, это очень много. Они вносят существенный вклад - и экологи, в первую очередь, специализирующиеся на водных системах, и потом не только водные, обомлели, потому что это было совершенно фундаментальное открытие. Это говорит о том, что их реконструкция пищевых цепей в морского планктона сделана неверно. Дальше были предложены красивые способы подсчета, когда фагов смотрят не в электронный микроскоп, а в люминесцентный – эти яркие точки - это бактерии, прокрашенные красителем, связывающимся с ДНК, а маленькие точечки – это вирусные частицы, и мы видим, как их много в воде, сконцентрированной с помощью специальной установки ультрафильтрации. Естественно, потребовалось объяснить, как же так получается, что в природных условиях у нас есть бактерии, есть специфичные к ним фаги, естественно, они никуда не деваются - ни те, ни другие, - следовательно, бактерии к фагам чувствительны, это можно показать экспериментально, но, тем не менее, они сосуществуют довольно стабильно, длительно никого не убивая под корень, хотя если мы берем пробирку с плотной бактериальной культурой и туда помещаем одну или несколько фаговых частиц, то через пару-тройку часов видим сплошной лизис. В этом удалось довольно быстро разобраться. Выяснилось, что есть несколько эффектов, которые обеспечивают укрытие для бактериальных клеток, то есть не то чтобы совсем делают их недоступными для фагов, а позволяют уменьшить действие фаговой инфекции на эту бактериальную популяцию. Королем этих укрытий является так называемое численное укрытие или, как говорят по-английски, numerical refuge. Что это такое? Абсолютные концентрации бактерий и фагов в среде довольно небольшие, тем более что бактерий много разных, фагов много разных, и они подходят к друг к другу достаточно строго. То есть фаги, специфичные для других бактерий, данную конкретную совершенно не волнуют, она боится только своих собственных фагов, и поскольку их концентрации низки, то вероятность встречи для каждой конкретной клетки невелика. И поэтому клетка успевает спокойно поделиться, и не один раз, пока одна из ее дочерних клеток наконец не будет лизирована фагом. Поэтому фаги время от времени подкармливаются редкими встречами, и бактерии вроде как размножаются. Если мы представим себе, что бактерия имеет размер примерно с человека, то окажется, что фаг имеет размер где-то с яблоко, тогда миллилитр жидкости будет представлять собой объем среднего размера озера. Как вы понимаете, если мы имеем одну бактерию, одного фага в миллилитре, они могут там жить почти бесконечно, никогда не встречаясь. Это соображение является принципиально важным, многие другие соображения немного изменяют количественные характеристики, влияющие на возможность встречи. Помимо численного укрытия существует физиологическое.
Некоторые бактериальные клетки в силу своего физиологического состояния могут быть невосприимчивы к фаговой инфекции. Обычно это разного рода покоящиеся формы или голодающие клетки. Есть разные степени невосприимчивости, я не буду сейчас на этом подробно останавливаться. Бывает физико-химическое убежище, связанное с тем, что в некоторых средах какие-то факторы среды – например, в рубце жвачных животных было показано, что это таниновые кислоты, - почему-то препятствуют адсорбции бактериофагов. То есть фагов довольно много, бактерий тоже, но есть некая химия, которая мешает им к бактериофагам липнуть, но не то чтобы совсем мешает на 100%, некоторые все-таки липнут, поэтому фаги там поддерживаются, но перебить все бактерии они не могут. Наконец, может существовать пространственная изоляция. Скажем, бактерии могут быть укрыты какой-нибудь слизью. Они вообще любят формировать так называемые биопленки, о которых мы еще сегодня вспомним, на границе раздела фаз, например, твердого и жидкого. Они разрастаются на поверхности воды или на каких-то твердых объектах в воде, выделяют большое количество полисахаридов и в этой массе живут, и фагам туда пролезть тяжело. Опять-таки - не то, чтобы невозможно совсем, но затруднительно. Таким образом все это существует, но из того, что я говорю, из соображения, что ведущим здесь является нумерическое укрытие, все остальное влияет по большей части на коэффициент диффузии или на константу адсорбции. Из этого следует очень любопытное утверждение, что фаги представляют собой бактерицидных агентов, активность которых в природных условиях зависит от концентрации видовой или штаммовой популяции. Что я имею в виду? Если у нас есть много видов бактерий - представим себе, что все присутствующие в этой комнате являются бактериями и каждая относится к своему виду, - то фаги, присутствующие одновременно, будут довольно мало влиять на каждого из нас, и мы сможем делиться. Но если кто-то будет делиться слишком успешно и начнет составлять большой процент, то смертность такой популяции от фагов будет выше, чем у остальных, и его будут немедленно придавливать. Но если в силу какого-то успеха какая-то популяция размножается феерически и заполоняет все, то ее может ждать фаговый коллапс, как это иногда бывает при цветении воды, вызванном цианобактериями, тогда она нарастает в таком количестве, что возможен массовый лизис с накоплением огромных количеств фагов. Получается, что фаги занимаются робингудством на молекулярном уровне, они отнимают органическое вещество у богатых и раздают его бедным - и это не преувеличение, поскольку если бактерию съело простейшее, какая-нибудь амеба или на самом деле жгутиконосцы - активные поедатели бактерий, то она превратит её биомассу в свою энергию, СО2 и Н2О, и другим бактериям от этого ни жарко, ни холодно, а если бактерию лизирует фаг, то большая часть органики, в ней содержащейся, вытечет наружу и станет доступна другим бактериям, то есть получается, что фаги отнимают энергию и вещество от наиболее успешных видов и передают их другим. И в результате оказывается, что в природных условиях вирусный лизис - как первичных продуцентов, так и наиболее успешных гетеротрофных бактерий, питающихся органикой, - активно стимулирует вращение вещества цепи, которая называется «микробная петля», ведь большая часть свободно живущих бактерий живет за счет растворенного органического вещества. Соответственно, чем больше происходит вирусный лизис, тем активнее оно высвобождается - и тем больше разнообразие, поскольку мы придавливаем слишком успешных, позволяя жить остальным, и тем больше общая метаболическая активность, поскольку ускоряется обращение этого вещества. Если хотите другую аналогию, то фаги, может быть, - аналог не столько робингудства, сколько реально работающего антимонопольного комитета – нам бы такой завести в нашем государстве.
Исходя из вышесказанного: выяснилось, что все эти пищевые цепи, на самом деле в моделях пищевых цепей не сходятся концы с концами, если мы не учитываем фагов. Это действительно одна из ведущих сил в мировой экологической среде в микробном мире. И эта фраза, за которую меня не любят производители фаговой терапии, я ее прочитаю: «Сложная игра между бактериями и фагами продолжается с большим азартом в течение всей обозримой истории биосферы, около 3 миллиардов лет, и вмешательство человека в эту игру, например, при осуществлении фаговой терапии является некоторого рода шулерским приемом, и для того, чтобы жульничать по-крупному, нам надо хотя бы полноценно усвоить правила этой игры». Если вдуматься, это практически полная аналогия, поскольку, как мы видим, в реальных природных системах концентрации бактерий, фагов и их активности зависят друг от друга. Не может взяться ниоткуда, там высокая концентрация фага - и долго никуда не деваться. Если мы создаем искусственно, это действительно жульничество, туз из рукава, но успех этой игры нам вовсе не гарантирован, потому что мы можем не понимать, что и как дальше будет происходить. Еще одно принципиальное отличие природной обстановки от лабораторной состоит в том, что в природной обстановке - как в организме человека и животных, так и в морях и океанах - фаговые частицы тоже смертны. Почему мы можем убить бактериальную культуру одной частицей в пробирке? Потому что она нашла первую клетку, произошло размножение, концентрация фагов несколько выросла, бактерии тоже могут расти за это время, однако фаги никуда не деваются, время их полураспада в пробирке значительно больше, в десятки раз, чем время размножения бактерий, и рано или поздно мы накапливаем большую концентрацию вируса, успешно убивая всех, кто к этому фагу чувствителен. В природе так не будет. Если фаговых частиц ввести много, они уничтожаются солнечным светом, они подвергаются механическому разрушению, окислению, крупных фагов могут съесть простейшие, мало ли ещё какая судьба может их постичь! Время полужизни фага в море порядка суток, это сильно зависит от условий, то есть там действительно существует некое истинное равновесие между их продукцией, которая зависит от плотности бактерий-хозяев, и распадом. Это напоминает карточную игру, и не всякая попытка нарушения этого равновесия приведет к выигрышу соответствующего игрока, несмотря на все его усилия. Мало иметь туза в рукаве, надо знать момент, когда его выпустить.
Нам, конечно, значительно любопытней знать, что творится с фагами и их хозяевами в нашем собственном организме, чем в морях и океанах и даже, несмотря на то, что первые эксперименты в этой области начал лично Феликс д’Эрель, и они опубликованы в 20-х годах, в реальности понимание экологии фагов таких микробных сообществ до сих пор находится в зачаточном уровне, и работы по этому поводу не формируют единого фронта. Они достаточно отрывочны, но известно, что фагов в нас много, не только в нас, в разных видах животных. Особенно их много в кишечнике. Эта картинка из нашей работы - некоторые морфологические типы фаговых частиц, все хвостатые, которые выделены из одного образца фекалий лошади. Я по этому поводу даже вспомнил фразу Дмитрия Николаевича Прянишникова: «Избыток навоза не компенсирует недостаток знания о нем». Однако, понимание того, в какой мере и как эти фаги действительно влияют на количественные показатели и активность тех бактерий, которые вместе с ними живут в кишечнике, вызывают ли они селекцию устойчивых к ним бактерий – или, наоборот, бактерии не обращают на них внимание, платя им небольшую дань? В общем-то, понятно далеко не до конца, и на самом деле примерно этим и занимается наша лаборатория, то есть мы работаем в академическом институте и по большей части занимаемся не самой фаговой терапией, а всякими теоретическими вещами типа экологии фагов в природных сообществах. Это дает нам некое право рассуждать о том, как все эти принципы экологии мы можем приложить к практической фаговой терапии. Научные знания, которые должны лечь в основу действительно современного терапевтического использования бактериофагов… Я упустил некую важную мысль: дело в том, что хотя фаговая терапия была забыта на Западе с 40-х годов по 80-е, интерес к ней резко возрос в последнее десятилетие XX века и продолжается сейчас в связи с проблемой устойчивости бактерий к антибиотикам. Я не буду много об этом рассказывать, понятно, что устойчивые штаммы, особенно госпитальные, множатся, скорость разработки новых антибиотиков упала, и, возможно, мы уже знаем почти все принципиальные классы антибиотиков, которые можно найти. Есть некоторая надежда на новые антибактериальные препараты, но их разработка происходит очень медленно, это связано с рядом экономических причин в фармацевтической индустрии, и, кроме того, антибиотики, как всем известно, вызывают большое количество побочных эффектов: мало того, что они довольно токсичны, они еще вызывают дисбактериоз, поэтому развитие фаговой терапии - относительно безопасной и имеющей почти неисчерпаемый потенциал поиска новых антибактериальных агентов к каждому конкретному патогену - вызывает большой интерес, и с 70-х годов на Западе появляется довольно много приличных публикаций по экспериментальной фаговой терапии. Но обычно лечат не людей, а экспериментально заражённых животных. Очень здорово перенос исследований на людей сдерживается фармацевтическими правилами и разными регуляциями, которые значительно свободнее в нашем отечестве, поэтому у нас лечат направо и налево, но, к сожалению, не очень применяя научный подход, поэтому получается, как говорил покойный Виктор Степанович, «как всегда». На мой взгляд, чтобы создать современную фаговую терапию и современные препараты, нужно учитывать примерно следующее: во-первых, надо разобраться в фармакодинамике фагов как антибактериальных препаратов. Понять, что они делают с бактериями в организме - и не только с каждой конкретной клеткой, с этим, конечно, понятно, а что они делают с популяцией. В частности, надо понять, как влияют особенности жизненного цикла, какой фаг лучше – тот, который, например, лизирует бактерию быстрее, но делает меньше фаговых частиц в расчете на одну клетку, или тот, который ждет дольше, но делает их больше. Соответственно - как действует специфичность хозяина, играет ли существенную роль появление in situ в каждом конкретном пациенте фагоустойчивых бактерий, ведь устойчивость к фагам, я сейчас об этом расскажу, развивается на раз, значительно легче, чем к антибиотикам, другое дело, что всегда можно найти другого фага к этому устойчивому мутанту и решить проблему. Вопрос о том, является ли это затруднением для каждого конкретного пациента или только для разработки препаратов вообще, остается открытым. Какие возможны варианты взаимодействия с клетками и с популяциями бактерий, и, как я сказал, фаги сожительствуют с бактериями 3 миллиарда лет и вовсе не стремятся их всех перебить, и иногда популяция бактериофагов образует очень любопытные, длительно существующие консорциумы, вовсе не желающие сразу умирать или терять один из своих компонентов. Во-вторых, существует проблема фармакокинетики фагов. То есть мы вводим препарат тем или иным способом, в организм человека или животного, мы должны понимать, куда он проникает, с какой интенсивностью, как он выводится из организма, где оседает, и как на это можно влиять, и как это приводит к какому-то эффекту. И, наконец, остается проблема безопасности фаговых препаратов, в частности - возможность их влияния на эволюцию патогенных бактерий, возможность других активностей фагов кроме антибактериальных, влияние примесей, которые неизбежно содержатся в этих препаратах. Ведь если требовать высокой степени очистки, они становятся очень дорогими, и так далее. Я пытался составить более или менее полный список, приведённый на слайде.
Теперь давайте пройдемся по стадиям жизненного цикла фагов и рассмотрим их с точки зрения фаговой терапии. Адсорбция и инжекция ДНК. Тут для нас важно, что адсорбция фага на поверхности клетки - это высокоточное молекулярное узнавание, например, частица фага Т4, которая своими адгезинами узнала какие-то рецепторы на бескрайней поверхности бактериальной клетки. Схема процесса для фага Т4 изучена в больших деталях, в том числе благодаря работам лаборатории, где я в свое время защитил кандидатскую диссертацию, Вадима Викторовича Месянжинова, и других лабораторий, показано, что сначала происходит взаимодействие длинных фибрилл, потом из-под базальной пластинки внизу хвоста разворачивается дополнительный комплект коротких фибрилл - и они связываются с другими рецепторами, происходит сокращение чехла хвоста и выдвижение вниз трубки, примерно так, как мы видели с вами в мультике. Фаг прокалывает стенку бактерии с помощью специальной белковой иголки, имеющейся на конце, эта иголка разбирается, хвост достигает внутренней мембраны бактериальной клетки и закачивает туда ДНК. Можно очень долго говорить о физике этого процесса, это очень интересно, но нас интересует то, что все начинается с очень точного узнавания фаговыми адгезинами каких-то конкретных молекул на поверхности бактерии. Вот некий список молекул, которые разные фаги узнают на поверхности своих бактерий хозяев. Нет необходимости его читать, можно увидеть, что они довольно разные. А эта схема для нас важна. Это рентгеновская структура – т.е. схема устройства белковой молекулы, которая существует на поверхности кишечной палочки, это белок, образующий пору в так называемой внешней мембране, через которую транспортируется специальное вещество, переносящее железо. Бактериофаг Т5, один из классических модельных объектов молекулярной биологии, узнает этот маленький кусочек этого белка, примерно 7 аминокислотных остатков. Очевидно, что, с одной стороны, можно немного изменить белок - и тогда клетка будет полностью устойчива к бактериофагу Т5, но, с другой стороны, оказывается что если мы отбираем бактерии в условиях жесткой селекции, то есть мы взяли и всю популяцию затравили фагами, соответственно, выживают немногие, с которыми что-то случилось, так что фаг к ним не адсорбирует. Большинство таких «выживантов» - это те, кто этого белка не имеют совсем. Этот белок где-то у них сломался, и его функция утрачивается вместе со способностью адсорбировать фаг. С одной стороны, для бактерий это хорошо: фаг ее не убьет, но, с другой стороны, такой мутант часто бывает (хотя не всегда) менее здоровым, менее жизнеспособным, чем родительский фагочувствительный генотип. И поэтому если фагоустойчивые мутанты отбираются, они часто бывают менее патогенными, менее вирулентными, менее способными к колонизации какого-то эпителия, и если фагов убрать, то родительские фагочувствительные виды часто их вытесняют. Такие феномены описаны. Однако если бактерии существуют без всяких фагов, то в них возникают разные мутации и возникают другие штаммы кишечной палочки, у которых, например, возникла замена аминокислотного остатка, не влияющего на функцию этого белка в целом. Она с ней живет, но в качестве бонуса получает еще то, что на ней не адсорбируется фаг Т5. Поэтому если мы найдем другой природный штамм, устойчивый к фагу Т5, это вовсе не значит, что он будет слабее чувствительного. Отсюда получается, что, с одной стороны, отбор фагоустойчивых мутантов на месте часто не очень спасает бактериальную популяцию, но, с другой стороны, для каждой конкретной бактерии фага надо подбирать. То есть фаги зачастую имеют штаммовую специфичность, то есть они убивают, как правило, не только бактерии определенного вида, а бактерии определенной группы штаммов в пределах этого вида. На этих таблицах данные из двух работ - одна из нашей лаборатории, другая из зарубежной публикации, - где для цели неких исследований люди посмотрели чувствительность определенного набора штаммов бактерий кишечной палочки к определенному набору фагов. И мы видим некую чехарду плюсов и минусов, то есть «да», «нет» и мы понимаем, что каждый фаг один штамм убивает, а другой – нет. В обоих случаях все эти штаммы - это полевые изоляты кишечной палочки из разных естественных источников. То есть для нас важный момент в адсорбции состоит в том, что она высокоспецифичная, хорошо это или плохо, судите сами. Прошла адсорбция - происходит внутриклеточное размножение фагов. Я сохранил этот слайд для того, чтобы сделать на нем паузу. Мы о ней говорить не будем, это содержание молекулярной биологии XX века, большого ее куска, безумно интересная тема, но нас интересует только то, что в большинстве случаев, если инфекция бактерий произошла вирулентным фагом, то бактерия обречена. Не всегда размножение фага в ней успешно, но, как правило, оно происходит - и бактерия лизируется. Существуют некоторые системы устойчивости бактерий, которые позволяют фаг внутри клетки заингибировать. Иногда клетка при этом выживает, иногда - нет, но давайте на этом феномене подробно останавливаться не будем, хотя он тоже может быть иногда важен для фаговой терапии.
Наконец, когда приходит время, в клетке синтезировано большое число фагов. На этой схеме вы видим схему того, как они собираются из разных групп. Я позволю себе даже не комментировать, чтобы не уйти в дебри. Это как конвейер, на котором одни частицы уже готовы, другие только начинают собираться, количество фагов накапливается - и в какой-то момент специальные белковые системы говорят: «Все, хватит!» - и клетка взрывается, не исчерпав на 100% свои ресурсы, и фаги выходят наружу. Выглядит это так – это электронная микрофотография лизированной фагами клетки, эти штучки – фаговые частицы, которые из нее лезут. Что там происходит? Внутри клетки накапливается фермент, способный разрушать жесткий слой ее оболочки, но он не может вылезти за пределы клеточной мембраны до тех пор, пока другой белок фага, так называемый холин, не сделает в нем дырку, а процесс образования дырки строго контролируется, он происходит через заданное время. Как только сделаны дырки, фермент сразу вытекает из клетки и довольно быстро разрушает клеточную оболочку - и клетка разрушается. С чем и связано это свойство переведения большей части органики этой клетки в растворимое состояние. Для фаговой терапии это свойство не очень актуально, а для морских экосистем мы это обсуждали выше. Интересно то, что фермент, который это делает, обычно не утекает далеко из лизированной клетки, потому что у него есть домен, кусок, который связывается с каким-то участком клеточной стенки вокруг, рвет все связи. В советских фильмах про грабителей показывали, когда они делали дырку в стеклянных дверях алмазным стеклорезом с присоской: прилепили, обвели круг и открыли. Эта штука работает таким же образом, поэтому фаговые лизины предложено использовать в качестве самостоятельных антибактериальных препаратов, ибо они способны связываться с определенными бактериями и избирательно убивать их. Особенно это хорошо получается с так называемыми грамположительными бактериями, кто знает, что это, – хорошо, а если кто-то не знает, то и Бог с ними, потому что для нашего разговора сейчас это не очень актуально. Правда, здесь тоже есть свои затруднения, которых мы тоже пока касаться не будем.
Следующий важный момент, который диктует нам структура фагового цикла, – это пороговый характер роста. Эта публикация, цитированная здесь, цитируется очень часто, хотя сама по себе работа не очень интересная. Люди заметили, что если поместить в пробирку фаг и бактерию и посмотреть, как они растут, то размножение фага начинается часто не сразу, а тогда, когда концентрация бактерий достигает определенного предела - порядка 104 клеток в миллилитре - и этот предел примерно соблюдается для различных систем фаг - бактерия. Почему? Поначалу было непонятно, хотя что тут непонятного, мне сложно сказать, все дело в простой математике, хотя искали физиологическое объяснение, но, на мой взгляд, оно значительно проще. Я понимаю, что эти выкладки вызывают некоторое неудовольствие у части аудитории, но давайте вспомним о том, что адсорбция фага - это взаимодействие двух частиц: бактерии и фага. Они как-то болтаются в броуновском движении, соударяются, и некоторые соударения приводят к тому, что они слипаются. Из школьного учебника по химии мы знаем, что обычно такие реакции имеют кинетику второго порядка, то есть скорость реакции зависит от концентрации обоих компонентов - концентрации бактерий, концентрации фагов. Если мы рассматриваем случай, когда бактерий много больше фагов, они при этом не тратятся, то получаются такие уравнения. Я прошу мне позволить не пытаться демонстрировать их вывод, я не очень хороший математик, но, поверьте мне на слово, это действительно следует из этого дифференциального уравнения. О чем это говорит? Это говорит о том, что время, которое нужно фагу для того, чтобы половина наличных частиц адсорбировались на бактериях, зависит от концентрации бактериальной популяции. Если бактерий много, примерно 108 клеток на мл, то время полуабсорбции среднестатистического бактериофага будет порядка 3,5 минут при константе примерно 2х10-9 мл/минуту. Если бактерий будет 106 в миллилитре, то есть миллион в миллилитре, на абсорбцию половины фага необходимо будет потратить 350 минут – это почти 6 часов, изрядное время. Адсорбция половины фага - это не очень значимый для эксперимента параметр, поскольку для того, чтобы увидеть его размножение, достаточно абсорбции меньшего количества, порядка 2%, потому что в среднем из одной клетки получается где-то сотня частиц - иногда больше, иногда меньше. Даже если взять 50, то 2% фагов отсорбировались, лизировали клетки и уже общее количество удвоится. Время, которое необходимо, чтобы адсорбировать 2%, будет примерно 10 минут при концентрации бактерий миллион в миллилитре и тысяча минут при концентрации 10 тысяч бактерий в миллилитре. То есть если время полураспада фаговых частиц в этой системе будет больше, чем время, которое необходимо, чтобы они адсорбировались так, чтобы размножиться в 2 раза, то мы будем видеть их рост – это простая арифметика. Отсюда следует, что если мы не будем накапливать фага, у нас есть его достаточно мощный сток в нашем организме. Это так, потому что фаговые частицы разрушаются в нашем организме довольно интенсивно, то тогда мы будем видеть с вами такие ситуации. Принципиальное отличие фага от антибиотиков и других антибактериальных препаратов состоит в том, что это дискретные частицы, каждая из которых потенциально способна убить бактериальную клетку. То есть с точки зрения популяции - да, существует концентрация фага, и она очень важна, с точки зрения конкретной клетки никакой концентрации фагов нет. Если она встретилась с одним-единственным фагом, то этого достаточно, чтобы умереть. Может быть, это один единственный фаг во всей Вселенной, специфичный к этой клетке, но ей просто не повезло. Если ей повезло больше, то фагов вокруг может быть много, а ей ни одного не досталось. Даже если у нас есть 10 фагов на каждую клетку, причем не просто вообще есть, а 10 фагов в среднем адсорбировалось на каждую клетку, то можно посчитать, что примерно 5 клеток из 100 тысяч фага не получат вообще, потому что какие-то получат больше 10. Отсюда получается, что есть два вывода. Во-первых, существует пороговый характер действия этого фага, существует концентрация бактерий, минимально необходимая для того, чтобы фаги росли, обычно это 104 и больше бактерий в миллилитре, если ничего им не мешает, и существует концентрация фага, которая позволяет остановить рост бактерий здесь и сейчас, не когда-нибудь потом, когда фаги накопятся, а прямо сейчас половину бактерий заразить, прежде чем они успеют поделиться – это концентрация порядка 107 фагов в миллилитре, это важно для терапии. Следующий вывод состоит в том, что фаги никогда в открытых системах, то есть там, где они не накапливались, там где есть сток, бактериальную популяцию под корень не выбьют, они просто не смогут долго поддерживать должную концентрацию, они убьют много бактерий, их самих станет много, но потом фаговый щит тоже разрушится, и какие-то выжившие бактерии, в том числе чувствительные к фагам останутся. Поэтому добивать патогена должна иммунная система. В связи с этим я считаю бесполезными модные идеи разработки фаговой терапии, например, для того, чтобы помочь детям, больным муковисцидозом, у которых в легких плещется экссудат, заражающийся всякими бактериями, - просто потому, что там можно с помощью фагового препарата снизить концентрацию патогенных бактерий, но никогда не до нуля, и если мы уберем фаг, она размножится обратно. Если мы говорим о раневой инфекции у относительно здорового человека, то шансы на успех гораздо выше. Грузины рапортовали, что у них получилась терапия на больших минновзрывных ранениях во время абхазских войн, то там все замечательно получается. Мы сводим популяцию бактерий к некоторому минимуму, когда иммунная система с ней уже справляется. Отсюда следующий вывод: фаговая терапия может быть активной, то есть в ситуации, когда разложение фага прямо в организме достаточно для того, чтобы поддерживать его действующую концентрацию, то есть больше, чем пороговая численность, нужная для того, чтобы подавить размножение бактерий. Это может быть, например, когда мы лечим какую-нибудь кишечную инфекцию, связанную с диареей. В некоторых экспериментах на коровах показано, что достаточно подержать корову в невычищенном стойле, где была корова, которую лечили фагами, для того чтобы она была защищена от экспериментального заражения неким коровьим диарейным микробом (там использовались штаммы шигелл). Примерно так может получиться, если патоген в крови. В данном случае проведены результаты эксперимента по лечению мышей от экспериментальной инфекции золотистым стафилококком. На графике - мышь, которую лечили фагами от бактерий в крови. Они выросли, поддерживались, затем добавили фага - и они упали почти до нуля. То же самое происходит практически во всех органах несчастной мыши. Почему несчастной? Потому что ее все равно потом убили, вытащили органы и померили там концентрацию фагов. В этой ситуации размножение фагов в мышах достаточно, и в полном соответствии с рекламными проспектами ФГУП Микроген, который производит фагов, достаточно одной частицы, чтобы вылечить животное. На самом деле вряд ли одной, 105 будет достаточно. Бывает также пассивная фаговая терапия. Ситуация, когда фаги разрушаются быстрее, чем они могут размножаться, но это не значит, что они не убивают бактерий. Мы можем лить их долго и упорно - и мы достигнем эффекта. Вот та же самая история. Если мы на мышах производим кожное заражение и обрабатываем их фагом сразу же вместе с бактериями, то все хорошо, не образуется абсцессов. Эти столбики отражают размер и число абсцессов на коже у мышей. Если мы действуем фагом несколько погодя, то абсцессы образуются, но их величина и размер каждого уменьшается, то есть в этой связи мы говорим о том, что у нас осуществляется пассивная фаговая терапия, мы вносим фага извне и долбим эту популяцию до тех пор, пока не задолбим. Отчасти это связано с тем, что бактерии любят делать биопленки – это такие разрастания, их иногда называют городами микробов, когда на какой-то поверхности образуются микроколонии бактерий, выделяющие специальную слизь, которая защищает их много от чего, в том числе - от фагов. Кроме того, они там приобретают особое физиологическое состояние, поэтому в этих биопленках обычно есть дырки, которые обеспечивают ток воды. Это реальный снимок на сканирующем микроскопе. Это бактерии, это слизь, их скрепляющая. Фаги могут инфицировать эти биопленки, но инфекция распространяется вглубь - медленно, но распространяется. Этому делу можно помочь, сделав генно-инженерного фага, который заставляет бактерию не только делать новых фаговых частиц, но еще делать внутри себя фермент, разрушающий мактрикс биопленки - и тогда пленка разрушается. И даже если фаги не добьют бактерии до конца, то нарушение структуры биопленки делает патоген доступным клеткам иммунной системы, и его могут доесть макрофаги. Так что применение фаговых препаратов зачастую оказывается более эффективным, чем применение антибиотиков, в ситуациях труднодоступных локализаций бактерий. Например, грузинские исследователи очень гордятся своими опытами лечения остеомиелитов у больных с инфекцией костей, в которых даже возбудители чувствительны к антибиотикам, но эти антибиотики туда плохо проникают. А фаги попадают в какое-то место, лизируют здесь бактерию, лизируют еще несколько бактерий в округе, потом эта волна достигает дырок в биопленке, естественно, фаги рассеиваются - и распространение массового лизиса на весь кусок биопленки не получается. Но мы добавляем фага еще и еще, ведем терапию в течение длительного времени и в конечном итоге достигаем успеха. Кроме того, в биопленках, когда мы их лечим антибиотиками, сохраняются так называемые клетки персисторы – это специальное состояние бактериальной клетки, когда она как бы спит, в ней подавлены многие биохимические процессы, я не буду останавливаться на том, как это достигается, но очень многие бактерии, примерно 10-4 клеток в популяции, впадает в такую спячку на всякий случай, и антибиотики на них не действуют. Не потому что они имеют какие-то специальные гены устойчивости, а потому что в них временно не работают те процессы, которые антибиотики нарушают. Зато эти персисторы выживают, и при исчезновении антибиотика они растут. Здесь мы видим эксперимент, очень знакомый тем из вас, кто имеет дело с генной инженерией. Если оставить эту колонию бактерий, она устойчива к ампициллину, который есть на этой чашке Петри. Устойчивость к ампициллину связана с умением бактерий разрушать антибиотик. Сначала выросла эта колония, она разрушила антибиотик - и потом вокруг нее вдруг начали расти мелкие колонии. Эти бактерии лежали на этой чашке, эти были клетки персисторы - и дождались своего часа, а большая часть других, которые были активны, погибли, а эти дождались и стали расти, хотя если мы их высеем отсюда на свежую чашку, то мы убедимся, что они чувствительны к ампициллину. Прелесть фагов состоит в том, что, по некоторым довольно скудным данным, они и персисторов тоже инфицируют, правда, не могут в них сразу размножаться, во всяком случае, некоторые не могут, но все равно инфицированная клетка персистор больше никого беспокоить не будет, потому что при ее активации наступает размножение фага, лизис и смерть клетки. Поэтому в некоторых случаях можно проводить длительные курсы фаговой терапии, эти фотографии любезно предоставлены Анджеем Горским, польским ученым, вице-президентом Польской Академии наук, который был у нас в лаборатории. Это терапия хирургической инфекции после масштабной операции на сердце, которая (терапия) продолжалась в течение 7 недель. И мы видим, что был достигнут существенный клинический результат, и стафилококковые инфекции шва были уничтожены, однако потом случился рецидив, и дополнительный цикл фаговой терапии опять позволил долечить этого пациента, который избавился от своей инфекции. Вся эта история относилась к вопросу о фармакодинамике фагов, то есть как они действуют на популяцию.
Остается еще немного поговорить о фармакокинетике. Как фаги распределяются в организме? Вообще-то, если мы купим фага российского производства в аптеке, то там написано, что эти препараты можно применять местно, это на самом деле правильно, правда, если вам еще повезет найти хорошую баночку, в которой фага будет достаточно много, они, к сожалению довольно вариабельны в этом отношении, но если повезет, то их можно применять местно, и стафилококковые инфекции на коже можно так победить. От системных или внутренних инфекций их предлагают пить. Есть некоторые клинические исследования, которые говорят, что это помогает. Я не знаю, что там в реальности происходит, поскольку хороших системных исследований на человеке проникновения фага из ЖКТ в кровь нет. Есть не очень хорошие исследования, которые мне непонятны. Они выглядят примерно так: выпили стакан препарата такой-то марки - и нашли, что фаги есть в крови. Сколько было фагов в этом стакане, каких, это неизвестно. А в хороших экспериментальных исследованиях на животных обычно оказывается, что модельные фаги в кровь так просто из питья не проникают, но зато неплохо проникают туда, если мы вводим их мышам внутрибрюшинно, или внутримышечно, или подкожно. У нас истекает время, поэтому я вынужден несколько скомкать эту историю. Здесь представлены данные лечения мышей от экспериментальной инфекции синегнойной палочкой, штамм Pall 1, и если мы лечим мышей через 48 или даже через 72 часа после заражения фагами, которые мы вводим внутрибрюшинно, то в некоторых экспериментах увидели почти 100% выживаемость этих мышей. Если мы вводим их подкожно, то результат немного хуже, порядка 33-50%, а в контроле, где вообще не лечили, практически все мыши погибли. Исследования содержания фагов в разных частях мышей показывают, что они появляются в крови, но довольно быстро исчезают оттуда, а накапливаются они в печени и селезенке, где разрушаются так называемой ретикуло-эндотелиальной системой, то есть клетками-макрофагами в тканях человека или животных. Однако выясняется, что существует возможность получать мутантов фагов, хуже распознаваемых макрофагами. Впервые это было опубликовано в конце 90-х годов, оказалось достаточно одной аминокислотной замены в белке головки фага, но этого белка довольно много, поэтому понятно, что это влияет. Этот мутант может циркулировать в крови в тысячу раз дольше, чем дикий тип, и, естественно, оказывается более эффективным в терапевтических воздействиях. Здесь показаны результаты исследования распределения двух фагов. Фаг W-дикий тип, wild, довольно быстро исчезает из крови, через 24 часа мы его не видим в крови, он оказывается в селезенке и печени, а фаг D-мутант остается в течение всего эксперимента в крови, и даже его количество в конце оказалось больше, чем вначале, что, видимо, связано с тем, что этот фаг размножался некоторое время в кишечнике мышей. В дополнительных экспериментах показано, что если мы вместе с таким фагом дадим мышам еще немного бактерий, то, во-первых, они их спасают от этих бактерий, а во-вторых, остаются в крови до 38 суток, правда, за это время в мышах начинают вырабатываться противофаговые антитела, и они, боюсь, их уничтожат. Оказывается, если влезть в это дело несколько глубже и поработать с конкретным фагом, то можно его, как говорят, доработать напильником, можно заставить его циркулировать дольше и, может быть, можно улучшить его проникновение из ЖКТ в кровь. Мы пытаемся организовать такие исследования, но это довольно тяжело логистически. Есть некие обнадеживающие данные, которые говорят о том, что проникновение частиц фагов в кровь из кишечника - это не пассивный процесс, активный, то есть определенные молекулы на поверхности клеток эпителия кишечника связываются с частицами и с какими-то целями перетаскивают их через этот барьер. Можно долго рассуждать о физиологии и биологическом смысле такого перетаскивания, но было продемонстрировано, что это действительно так, и, по всей видимости, есть надежда подобрать специальные генетические – или, может быть, не генетические изменения поверхности фагов, которые будут улучшать его перенос из поверхности кишечника в кровь. Но я не уверен, что то, что мы можем подобрать мышам, будет работать в людях, но все мои попытки организовать такой эксперимент на людях – кстати, довольно безопасный эксперимент: надо дать попить фага добровольцам или даже больным и потом брать кровь, - вызывает большие затруднения организационно-практического характера, врачи, например, говорят: «А как мы с вами будем обосновывать необходимость такого частого взятия крови?» Мое время практически истекло, поэтому я думаю, что на этом нам стоит разговор завершить. Я благодарю вас всех за внимание и буду рад ответить на вопросы.
Обсуждение лекции
Борис Долгин: Когда речь шла о том, что взяли океанскую воду и проанализировали, прозвучала мысль о том, что пришлось существенно пересмотреть представления о пищевых цепочках. А как пересмотреть? Как это выглядит теперь? Что изменилось?
Андрей Летаров: Оказалось, что необходимо учитывать, что определенный, довольно значительный процент биомассы, причем разных групп - как продуцентов, так и прочих микроорганизмов - подвергается вирусному лизису, и это органическое вещество перераспределяется между другими бактериями, и если мы пытаемся предсказать активность и численность разных видов, рассчитывая, сколько им достанется пищи, то мы сделаем серьезную ошибку, если мы не учтем…
Борис Долгин: То есть это просто нормальные изменения параметров в уравнениях?
Андрей Летаров: Да. Выясняется, что в этих моделях не сходятся концы с концами, если не учесть фагов и все остальное померить аккуратно.
Борис Долгин: Теперь сходится?
Андрей Летаров: Утверждается, что да - до тех пор, пока не откроют какой-нибудь еще… Вообще на самом деле так часто бывает, какое-нибудь явление везде, мы постоянно стукаемся об него лбом и не замечаем до тех пор, пока не найдем кнопку. Как только мы можем им немного поуправлять, допустим, на чашке вырастить или еще как-то…
Борис Долгин: То есть побыть инженерами своего рода.
Андрей Летаров: Да. Люди столько лет делали пиво до тех пор, когда Луи Пастер не сказал: «Елки-палки, дрожжи его делают», - и, причем, с ним долго спорили долго.
Борис Долгин: А как выглядят фаги в эволюционной перспективе: что это, кто это, как это, когда это?
Андрей Летаров: На самом деле, очень тяжело ответить на этот вопрос по той причине, что все попытки реконструировать уходят в настолько глубокое прошлое, что возникает впечатление, что фаги были уже в тот момент, когда не только грамположительные, грамотрицательные бактерии разделились, это 3 миллиарда лет назад, а еще одна ветвь архей была недалеко, поскольку у них бывают похожие вирусы, и как оно вышло, можно только гадать. Гадать пробовали, я тоже пробовал - на картах, на кофейной гуще, - и у меня получилось, что, скорее всего, фаг - это продукт развития так называемых эгоистических ДНК, типа плазмид или транспозонов и, видимо, первый фаг на самом деле не размножался эффективно в литическом цикле, а переносил плазмиды от одних клеток к другим и за счет этого жил. По этому поводу была моя первая серьезная публикация, это было довольно нагло для аспиранта, который еще не опубликовал ни одной нормальной статьи, хотя, нет, одна у меня была, я написал по этому поводу обзор в 1998 году, могу дать почитать.
Борис Долгин: Да, спасибо. Тут прозвучали еще, видимо, «археофаги»... Или как их называют?
Андрей Летаров: Назовем их вирусы архей.
Борис Долгин: Вирусы архей. А в чем сходства, различия, объединяют ли их как-то вместе?
Андрей Летаров: Поскольку и те, и другие считаются формально прокариотами…
Борис Долгин: В смысле - бактерии и археи.
Андрей Летаров: Бактерии и археи. Соответственно, какое-то дежа вю, когда я где-то говорю о фагах, все это скатывается к разговору об отличии архей от бактерий. Есть две ветви архей: Euryarcheota и Crenarcheota. У эвриархеот, которые с виду немного поближе к бактериям, не то чтобы филогенетически, скорее - по организации, есть фаги, похожие, в том числе, и на хвостатые фаги нормальных бактерий, а у кренархеот вирусы совершенно странные, похожие на какие-то лимоны, на какие-то палки, некоторые из них не лизируют клетки, а выращивают там какие-то пирамидки, которые прокалывают стенку. Их разнообразие очень велико, семейства описываются чуть ли не ежегодно, по-моему, всего 2-3 лабораториями, одна из них, кстати, руководима Давидом Прангишвили, бывшим советским грузинским ученым, который теперь работает в институте Пастера в Париже, и, к сожалению, они успевают характеризовать их геномы, немного посмотреть на циклы, но разобраться подробно – это дело некого будущего, то есть действительно археи - это мир совсем другой, но они патогенными не бывают, поэтому к фаговой терапии это никакого отношения не имеет.
Борис Долгин: Поскольку бороться не так актуально, то изучают это медленнее.
Андрей Летаров: Не совсем так, просто руки пока еще не дошли.
Борис Долгин: Спасибо. Коллеги, вопросы и реплики. Просьба представляться.
Константин Иванович: Скажите, пожалуйста, вы не сказали, насколько чувствительны фаги к температурным режимам и к влажности, и связано ли это с сезонными заболеваниями - зима, весна, лето, осень? Спасибо
Андрей Летаров: Спасибо, Константин Иванович, вопрос понятен. На самом деле чувствительность фагов к разным биоцидным агентам очень здорово отличается от фага к фагу. Как правило, они неплохо переносят нагревание градусов до 45-50 и довольно кислую и довольно щелочную среду. Высушивание их часто губит, но не до конца. Есть, например, замечательный фаг Т1 – гроза производств, основанных на кишечной палочке, например, рекомбинантного инсулина, потому что он отлично переносит высушивание и если где-то заводится, то вывести его из производственного помещения будет тяжело. С сезонными заболеваниями вряд ли это связано, хотя это хорошая мысль. Еще д’Эрель - по этому поводу был чуть ли не скандал в те далекие годы - считал, что фаги - это важное звено иммунитета, и до сих пор есть некие теории, говорящие о том, что природные фаги в естественной микрофлоре могут составлять некоторую защиту от бактериальных патогенов. Я, честно говоря, не думаю, что они напрямую эту роль выполняют, но думаю, что в связи с тем, что гомеостаз организма работает довольно хорошо, даже в очень жаркую погоду температура внутри нас не сильно выше, чем в холодную погоду, если мы живы, конечно, поэтому вряд ли сезонные заболеваниями связаны именно с этим.
Борис Долгин: Спасибо. Еще. Просьба представляться.
Валерий, Биохим, МПГУ: Скажите, пожалуйста, а геном бактериофага - насколько он большой относительно бактериофага λ, то есть у него есть 50 тысяч нуклеотидных пар и какой геном, например, у трансгенных бактериофагов, которые делает человек?
Андрей Летаров: Спасибо, вопрос понятен. Я не сказал фразу, которую думал. Естественно, когда мы с вами говорим бактериофаг - если мы биологи, к сожалению, врачи иногда употребляют это слово иначе, - для нас бактериофаг - это вполне конкретная биологическая сущность, конкретный вид, штамм фага, конкретный вирус. Так вот, геномы фагов бывают, я имею в виду хвостатых фагов, давайте на них остановимся, от примерно 10 тысяч пар до более 500. Типичные размеры - это либо 40-60, либо 130-200, бывают и промежуточные, но их поменьше. Что касается трансгенных фагов, то их геномы примерно такие же, как у тех, из которых эти трансгены сделаны, за исключением ряда специфических ситуаций, когда кто-то поработал над изменением размера головки. Это иногда удается сделать в специальных целях, но в среднем примерно то же самое, поскольку задача состоит не в том, чтобы запихнуть как можно больше какого-то нового материала, а в том, чтобы направленно изменить нужные свойства. Я воспользуюсь случаем, чтобы еще раз подчеркнуть, когда мы видим банки, на которых написано «Бактериофаг синегнойный», купили в аптеке, это не значит, что нам продали штамм фага, это значит, что нам продали какой-то коктейль, где этих фагов может быть довольно много разных, и на самом деле - открою вам тайну, что даже производители не знают, сколько и каких. Это большая проблема. Часто доктора говорят: «Есть «Бактериофаг синегнойный» уфимского производства, и мы протестировали, что эти бактерии к нему чувствительны», мне как биологу это вообще ни о чем не говорит, это значит, что накапали из этой баночки капельку и увидели там какой-то лизис. Ко всем фагам в этой банке чувствительны бактерии, к некоторым, или это вообще не фаг, а консервант (такое тоже бывает)? Тут требуется вдумчивый подход.
Борис Долгин: Когда-нибудь объединение усилий ученых и производителей ожидается? Так, чтобы производители знали, что они производят, ученые примерно понимали, что же…
Андрей Летаров: Знаете, работают. На самом деле нет никаких отвратительных злодеев - и производители хотят делать хорошие фаги, и ученые не прочь над этим поработать, но не всегда удается все это воедино свести, например, для того, чтобы понимать, нужно перестроить все производство – это довольно дорого стоит. Какие-то исследования, сейчас, я знаю, лаборатория в Институте биоорганической химии моего хорошего знакомого Мирошникова, и с моими коллегами они занимаются созданием специальных систем, которые позволят производителям хотя бы приблизительно с помощью дешевых экспресс-тестов разобраться, что же они там такое произвели, хотя они в принципе думают о переходе на другой уровень техники, которая позволила бы делать более современные фаговые препараты.
Максим: Добрый день! У меня такой вопрос: есть ли данные об исследованиях лизиса бактериофагами грибных клеток?
Андрей Летаров: Данные есть. Грибные клетки фагами не лизируются никогда ни за что, но у грибов есть свои вирусы грибов, но это эукариотические вирусы, в которых я не разбираюсь.
Евгений: Добрый день! Скажите, правильно ли я понял, что сейчас неизвестно, каким образом фаги поступают из желудочно-кишечного тракта в кровь и дальше из крови?
Андрей Летаров: В сущности, да, вы правильно поняли.
Евгений: То есть, судя по мышам, они как-то поступают, но как – неизвестно.
Андрей Летаров: Судя по мышам, они не очень поступают. Тут, правда, есть одна тонкость - проницаемость разных барьеров, в том числе - в мышах, может сильно различаться у больных мышей и у здоровых. Еще в 1943 году было опубликовано очень красивое исследование, где мышей заражали возбудителем дизентерии в мозг. Я, честно говоря, не очень понимаю, что нужно делать в практической жизни, чтобы получить дизентерийный менингит, но оказалось, что у этих мышей фаги из внутрибрюшинной инфекции проникали в мозг, размножались там и спасали от мозговой дизентерии, а если этих фагов вколоть здоровым мышам, то в мозгах их не обнаруживалось, то есть гемато- энцефалический барьер почему-то по проницаемости для фагов различался, во всяком случае, в 1943 году, у мышей кардинально в зависимости от физиологического состояния. Поэтому я не исключаю, что при каких-то кишечных расстройствах, может быть, фаги проникают в кровь значительно лучше, чем у здоровых животных.
Евгений: То есть, в общем, они все-таки проникают, просто пока неизвестно, как и что этому способствует?
Андрей Летаров: Есть русские работы, и люди серьезно говорят, что они пользуют фагов в урологии, что они мало что проникают, так еще выделяются с мочой. Я не очень понимаю, как частицы размером в сотни нанометров будут фильтроваться через базальную мембрану капилляров почечных клубочков, но, тем не менее, может, при нефритах, если белок есть в моче, то почему бы не быть фагу, может, оно и работает, но это все надо исследовать с особым цинизмом, и, к сожалению, может выясниться, что у мышей это так, а у людей - совсем иначе. С другой стороны, если есть такие успехи у клиницистов, это заслуживает серьёзного внимания.
Евгений: И вдогонку еще один вопрос. А не может ли быть, даже если фаг не проникает, но он «вычищает» желудочно-кишечный тракт, освобождает иммунитет от этих забот и поэтому иммунитет лучше работает?
Андрей Летаров: Фаги высокоспецифичны, и если у вас, допустим, какой-нибудь стафилококк в почках, то убиение его в кишечнике может не состояться, потому что его там нет.
Борис Долгин: И ничего другого не убьет.
Андрей Летаров: Да, стафилококковый фаг ничего другого не убьет потому что они не только видо-, они еще и штаммо-специфичны, за редким исключением, и, может быть, они могут обладать прямым действием на иммунную систему, этой идеей очень увлекаются польские коллеги, но это вообще отдельные дебри, в которых, может быть, лет через 10 удастся разобраться. Они утверждают, что фаговые частицы сами по себе взаимодействуют с иммунокомпетентными клетками и как-то на них влияют, например, уменьшая миграцию опухоли, но это действительно к антибактериальной активности не имеет никакого отношения, и есть еще один важный момент - большинство препаратов, которые сейчас продаются, - почему их предлагают пить, а не вводить внутримышечно? Потому что это просто грубые лизаты бактерий, немного очищенные центрифугированием и фильтрованием, скорее фильтрованием, они содержат довольно много обломков бактериальных клеток, и эти обломки часто обладают своей собственной, в том числе иммуностимулирующей активностью. До недавнего времени в Соединенных Штатах производили некий фаговый лизат, который с успехом употребляли как иммуностимулятор, то есть действие препарата из аптеки может не полностью заключаться только в антибактериальной активности.
Борис Долгин: Потому что вызвано его совершенно другим составляющими.
Андрей Летаров: Может быть вызвано не только фаговой составляющей, но на мой взгляд, лучше мухи отдельно - котлеты отдельно.
Даша, ИНМИ: Здравствуйте, скажите, пожалуйста, а что известно о бактериофагах гипертермофилов, гипертермофилах вообще, и как они выживают при таких условиях, и как на них действует автоклавирование?
Андрей Летаров: Спасибо, Даша. Про бактериофагов гипертермофилов известно, что они есть. Это, как правило, археи, и у них самые странные вирусы во множестве выделены, или зачастую они даже их не лизируют с образованием бляшек, например, накапливаются очень часто в культуре, они являются в наших терминах умеренными и выделяются лизогенными археями. Как они выживают в этих условиях, Бог их знает, но, вероятно, благодаря тому, что они имеют термостабильные белки, так же, как и их хозяева. Что касается их автоклавирования, я никогда не пробовал их автоклавировать, но я полагаю, что…
Борис Долгин: Что такое автоклавирование?
Андрей Летаров: Автоклавирование - это прогревание паром под давлением, то есть скороварение, грубо говоря.
Я никогда не слышал о таком эксперименте, но это хорошая идея. У тех, которые живут в гипертермофилах под водой, в «чёрных курильщиках», где и вода, и давление, и температура 120°, наверное, если у них есть фаги, то они должны быть устойчивы к автоклавированию, но мне в руки такой объект никогда не попадался, я обязательно попробую посмотреть в литературе, можно даже написать Давиду Прангишвили и спросить, что он думает.
Ибрагим: Здравствуйте, скажите, а от лечения бактериофагами наблюдаются какие-нибудь побочные негативные воздействия?
Андрей Летаров: Побочные эффекты?
Борис Долгин: И как выделить в этих эффектах воздействие бактериофагов, а не прочих примесей?
Андрей Летаров: На удивление мало сообщений о существенных побочных эффектах от лечения бактериофагами. Часть таких сообщений носит характер устного предания: «Мы попробовали - стало хуже». Что и от чего стало хуже, непонятно, поскольку, во-первых, случаи единичные, и не очень понятно, связано ли действие с бактериофагами или с тем, что просто человеку просто так совпало, что стало хуже. Вы понимаете, когда людей много, то кому-нибудь обязательно станет хуже на следующий день после приема фагов, даже если всем будем давать плацебо.
Борис Долгин: То есть, строго говоря, нормальных экспериментов, которые бы давали негативные результаты…
Андрей Летаров: Эксперименты с контролем безопасности были. Научных результатов, говорящих о том, что от них становится сильно хуже, нет. Недавно были осуществлены несколько safety trail по современным европейским стандартам бельгийцами и швейцарцами другими фагами, у них получились результаты, что - да, это совершенно безопасно. Есть некоторые осуществляемые попытки - в том числе, и нами - разобраться, как действуют фаги на кишечные бактерии. Особенно интересуют фаги кишечной палочки, потому что некоторые штаммы кишечной палочки патогенны. Насколько они могут действовать на резидентную кишечную палочку, это довольно интересный вопрос, до сих толком пор не выясненный, но из общих соображений я думаю, что вряд ли можно фагами убить всю резидентную кишечную палочку и вызвать серьезный бактериоз. В некоторых случаях можно предполагать, что могут быть осложнения, если в ситуации, где очень много доступных бактерий для фагов в организме присутствует, они начинают дружно лизироваться, и кусочки бактерий могут вызвать токсический шок. Такая возможность теоретически обсуждалась, но ни одного подтвержденного случая токсического шока из-за фаговой терапии в литературе, я, во всяком случае, не видел. Есть еще одно очень активно дискутируемое опасение о том, что фаги могут переносить бактериям и какие-то нежелательные гены. И действительно, теоретически могут, но во-первых, с одной стороны, неиспользование умеренных фагов сильно ограничивает эту возможность, а кроме того, бактерии, в общем-то, и без нашей помощи энергично обмениваются генами, и за все время реального опыта человечества в области фаговой терапии я не видел и не слышал ни одного ни устного, ни письменного сообщения о том, что in vivo был образован какой-то убийственный штамм, который что-то сделал. У меня такое ощущение, что это на самом деле больше теоретическое опасение. Теоретически такое возможно, но, на мой взгляд, иногда надо рисковать. Мы, например, точно знаем, что антибиотики вредны и, тем не менее, их применяем, потому что некуда деваться. Мы предполагаем, что, может быть, теоретически в очень небольшом проценте случаев от фаговой терапии можно помереть, но соответственно, от антибиотикотерапии можно помереть с вероятностью порядка на три больше. Надо выбирать.
Голос из зала: Скажите, пожалуйста, есть ли фаги против особо опасных инфекций, какая их реальная значимость против этих инфекций?
Андрей Летаров: Фаги против особо опасных инфекций есть. Я упомянул, что еще д’Эрель лечил чуму, кстати, чума - это энтеробактерия, поэтому к ней довольно много фагов, холеру, причем история в Индии была очень забавная. Они пытались поставить контролируемое исследование, то есть в определенных областях назначенные опытные фаги давали населению, в других – нет, и через некоторое время был достигнут настолько хороший эффект, что индийское правительство решило прервать эксперимент и давать фагов всем, потому что так можно спасти людей, но зато найти нормального доказательства концепции, к сожалению, не удалось, хотя результаты были очень обнадеживающие. Есть фаги противосибиреязвенные, я не говорю, что есть лечебные противоосибиреязвенные препараты, хотя в литературе обсуждались, но фаги у этих организмов присутствуют, а чумные и холерные были даже использованы на практике. Подробнее - это, к сожалению, не очень ко мне, поскольку этим занимаются довольно специфические органы.
Голос из зала: Скажите, пожалуйста, а какие вообще болезни лечатся фагами? Меня, прежде всего, интересуют аллергии, экземы, можно ли применять? Потому что процесс идет, постоянно образуются клетки.
Андрей Летаров: При аллергии довольно бессмысленно: фаги не иммуносупрессоры в прямом смысле. Лучше всего из того, что лечится сейчас, похоже, получается со стафилококковыми инфекциями, вызванными золотистым стафилококком, кстати, в том числе и знаменитым метициллин-резистентными стафилококками, MRSA, поскольку устойчивость к антибиотикам с устойчивостью к фагам особо не коррелирует. Успех этого предприятия во многом обусловлен тем, что почему-то среди стафилококковых фагов много вирусов с очень широким спектром, которые покрывают одним штаммом очень большое количество штаммов стафилококков. Можно лечить много разных бактериальных заболеваний, где есть какая-то популяция патогена либо расположенная внеклеточно, либо так, чтобы до нее можно было хоть как-то добраться, например, иногда бактерии внутри макрофагов фагами тоже можно достать, если скормить им зараженные клетки бактерий. Такие эксперименты тоже делались. Мне кажется, что вряд ли получится лечить фагами туберкулез, потому что это медленная инфекция со своими патологическими особенностями локализации. Явно бессмысленно лечить фагами хламидиозы или риккетсиозы. Кишечные, особенно Е.coli инфекции, то, что связано с диареей, правда, дизентерийная бактерия, в том числе, и внутриклеточно может размножаться, но практика показывает, что, видимо, внеклеточная популяция тоже очень важна, и подавление ее сильно улучшает ситуацию. Кожные инфекции – это хорошая мишень, поскольку можно применять фаги местно. Раневые инфекции, в ожоговой терапии пытались активно. Вроде бы хорошие результаты получаются у урологов с кишечно-палочными нефритами и циститами, но тут мы только что обсуждали вопрос о том, как они туда должны проникнуть, там придется вводить либо катетером, либо уповать на то, что они действительно выделяются с мочой, что крайне странно. Вот так примерно.
Юрий Дуреба: Здравствуйте. Скажите, пожалуйста, если принимать фаг как кусок кода после того, как он инфицировал клетку, он после этого становится без части своего кода, правильно?
Андрей Летаров: Не понял.
Юрий Дуреба: Он часть свою вовнутрь клетки…
Борис Долгин: Меняется код фага после того, как…
Андрей Летаров: Теперь понял.
Юрий Дуреба: Он активный после этого остается, он воспроизводится сам - фрагмент, который он ввел в середину, или он становится холостой?
Андрей Летаров: То, что вы называете кодом, наследственная информация вируса - это нуклеиновая кислота, которая внутри, молекула ДНК. Вся эта сложная конструкция снаружи - это средство доставки, она действительно остается снаружи и потом больше не используется, он одноразовый, но молекула ДНК, введенная в бактерию, заставляет эту бактерию делать внутри себя, во-первых, еще такую ДНК, то есть она копируется, а кроме того, она заставляет делать белки, из которых собираются новые частицы, и ДНК в них упаковывается, поэтому фаговое потомство воспроизводится полностью. Части, которые остались снаружи, потом вырабатываются в клетке новые.
Юрий Дуреба: То есть он живет только до оплодотворения, потом он погибает?
Андрей Летаров: Оплодотворение в данном случае не очень хороший термин. До инфекции.
Юрий Дуреба: Хорошо. Еще такой вопрос: существуют ли клетки, у которых нет фагов?
Андрей Летаров: В смысле - бактериальные, бактерии?
Юрий Дуреба: Любые.
Андрей Летаров: Фаги - по определению вирусы бактерий, то есть если это клетки не бактерий, у них, конечно, нет никаких фагов. Другой вопрос, существуют ли виды бактерий, у которых нет фагов. Ответить на него сложно. Как правило, если для какого-то вида бактерий фага очень хорошо поискать, то он рано или поздно находится, но это не относится к хламидиям, рикециям. Есть такая забавная бактерия Bdellovibrio bacteriovorus, которая представляет собой хищника, это такая маленькая бактерия, которая крепится к другим, делает в них дырку, пролезает внутрь, там все выедает, а потом выходит, то есть она тоже может делать бляшки наподобие бактериофаговой, так вот у этой бактерии тоже нашли фага, правда не хвостатого. Фаги - это очень древняя эволюционная находка, и они есть почти у всех, потому что они были еще до того, как эти все разделились.
Борис Долгин: Я все-таки перейду к вопросам, которые нам заранее отправили. Сейчас у нас есть возможность в анонс читателям написать вопросы. Будем чередовать. Были ли попытки генетически модифицировать фаг или получить его полностью синтетически?
Андрей Летаров: Попытки генетически модифицировать фага были и производятся каждый день, в том числе есть вектора на основе фагов, это рутинная исследовательская практика. Получить его полностью синтетически - таких попыток не было, хотя можно себе представить. Некоторые довольно простые фаги можно получить в бесклеточной системе трансляции. Я не знаю, можно ли их назвать синтетическими: можно из клетки выделить белоксинтезирующий аппарат и попробовать в пробирке собрать такого простенького РНКового фага, не вижу в этом ничего невозможного.
Борис Долгин: Собственно, с попытками создать искусственную жизнь, почему бы не создать и фага?
Андрей Летаров: Можно, только что это будет доказывать? Фаг не совсем живой, и чтобы он был живой нужен хозяин, а создать искусственную бактерию довольно затруднительно, хотя тут были важные продвижения недавно.
Борис Долгин: Пытались ли вывести фаг для конкретного штамма бактерий, например, выращивая чистую линию этих бактерий, взятых у больного на питательной среде, а потом отбирая фаги, успешно ее заражающие?
Андрей Летаров: Да, пытались, это и есть наиболее правильный modus operandi.
Борис Долгин: Насколько иммунитет больного мешает фагам, можно ли специфически подавить иммунитет против фагов хотя бы на этапе формирования иммунной системы?
Андрей Летаров: Очень хороший вопрос. Экспериментально показано, что при длительном использовании фагов или при длительных сроках после парентерального введения фагов, то есть уколов, могут вырабатываться антитела, которые их нейтрализуют. Бороться с этим сложно. Можно взять, например, другой фаг, другого антигенного типа, антитела против первого ко второму липнуть не будут. Как-то так выходить из этого положения. Подавить иммунитет, конечно, можно, но, я думаю, вас за это посадят в тюрьму.
Юрий: Большое спасибо за лекцию. У меня такой вопрос: каким образом промышленное производство бактериофагов можно наладить, как транспортировать, как быстро это можно сделать? Если, например, та же самая чума в Гаити - как быстро, если вдруг принять решение лечить людей, как быстро можно наладить, и можно ли на одном и том же оборудовании налаживать производство различных видов бактерий?
Андрей Летаров: Наладить можно. Работают производства большой мощности того же ФГУП «Микроген», который и продает все эти фаги. Это делается в ферментерах – специальные сложным образом оборудованные бочки, в которых размножают бактерии, их заражают фагами. Проблема в том, что довольно тяжело вырастить много разных фагов сразу, потому что это получается дешевле, если использовать большие бочки. Они пытаются найти некие решения. Я не хочу ругаться на «Микроген»: они на меня обидятся, и это ни к чему. Но технически действительно нетривиально, и большинстве случаев вопрос решается так: создается некий центр фаговой терапии, как в Тбилиси или в Польше, где люди лечатся полулабораторно, где в небольших количествах, например, 10 л фага выращивают. У них есть много таких бутылок, и они к нужному штамму подбирают нужный штамм из своей коллекции и делают, может быть, коктейль фагов и его выдают. В некоторых случаях подбирают или даже выделяют заново фага под больного. Это делалось, даже более того, иногда это делают специалисты того же «Микрогена», и такие индивидуализированные препараты работают в разы лучше, честно скажу. Поэтому, на мой взгляд, наиболее правильная организация фаговой терапии, наиболее эффективная - это некоторое научно-производственное объединение, в котором есть клиника, где люди приходят, либо приносят штамм, либо выделяют, подбирается фаговый препарат, есть куча других тонкостей, которые было бы желательно учесть, - и производится индивидуализированная терапия. Так примерно делают поляки, но производительность там будет меньше, чем при массовом производстве. Пытаются выйти из положения, создавая коктейли фагов, которые бьют значительную часть спектра циркулирующего в данный момент возбудителя данного вида. Получается по-разному, поэтому часто выходит, что когда вы покупаете фага в аптеке, вы как бы играете в лотерею. Люди сейчас возмущаются: как совместимо здоровье с лотереей?! В общем, совместимо, потому что вы рискуете только деньгами. Если фаг не сработает, вы вряд ли получите какой-то серьезный негативный эффект - в отличие от употребления антибиотиков, которые не подходят против вашего патогена. При этом часто говорят: «Пожалуйста, купите не просто фаг пиобактериофаг, а пиобактериофаг производства именно уфимского филиала», - потому что они действительно разные, независимые коллекции, и лучше следовать этим указаниям, хотя зачастую надо было бы сказать, что… помните, был какой-то советский фильм, забыл, где собрались за столом сотрудники винного завода в ресторане, принесли бутылку и говорят: «Слушайте, это разлито такого-то числа, вы помните, что было в этот день?» «Унесите». Банка от банки может отличаться довольно сильно, но это биология, поэтому лучше было бы, конечно, иметь центр, где все под контролем
Голос из зала: Спасибо за лекцию, она очень интересная. Но, вы знаете, я шел на лекцию в надежде на то, что услышу, что антибактериальная терапия и терапия антибиотиками зайдет в тупик достаточно скоро, и я думал, что вы нам откроете светлый путь, что лечение бактериофагами - это достаточно перспективная вещь. Этого я от вас не услышал, я понял, что это достаточно сырая вещь. Скажите, пожалуйста, с точки зрения микробиолога, какой же путь лечения бактериальных инфекций?
Андрей Летаров: Спасибо за вопрос, я вас понял, давайте так для начала - антибиотикотерапия совсем ни в какой окончательный тупик не зайдет никогда, потому что большая часть бактериальных инфекций подхватывается нами в такой обычной среде, дома или на улице, и они, как правило, чувствительны к какому-то спектру антибиотиков, и зачастую их проще вылечить антибиотиками, чем мучиться с бактериофагами, даже несмотря на побочный эффект, и, скорее всего, так будет более или менее всегда. Существенная проблема – госпитальные инфекции, а также ситуации, когда хочется пощадить организм, допустим, у беременных, и несмотря на все мои разговоры о том, что действительно, правда, фаговая терапия - очень сырая технология, она значительно сложнее, причем она и для врача сложнее, потому что это надо держать в голове, но, тем не менее, оказывается, что зачастую даже путем каких-то простых решений удается сильно поднять успешность этой деятельности, если хотя бы следовать простым правилам: что нужно, прежде чем применять фаг, микробиологическим посевом доказать чувствительность этого возбудителя, дальше нам надо применить препарат с подтвержденной нормальной концентрацией этого фага к этому возбудителю; есть люди, которые подумали над тем, как его изготовить так, чтобы можно было ввести, чтобы он достиг цели, - то все будет получаться - хотя не настолько легко, как с антибиотиками. На самом деле, есть альтернативные подходы. Один я упомянул – это использование фаговых литических ферментов, там тоже есть много своих проблем, но больше и надежд, потому что они специфичны, но не настолько узко, как бактериофаги. Есть попытки разработать принципиально новые антибактериальные синтетические препараты, которые антибиотики, - по большей части, продукты жизнедеятельности каких-то других микроорганизмов, грибов или других бактерий, можно найти новые мишени в клетках бактерий и сделать к ним новые препараты. Я думаю, что разумно сочетать все эти подходы, и, на мой вкус, лучше всего фаговой терапии занять две ниши: некого средства, которое неплохо попробовать в не очень тяжелых ситуациях, потому что если поможет, то будет легче, чем с антибиотиками, здесь можно использовать, в том числе, и коктейли широкого спектра действия, - и некоторого последнего довода в случае, если мы имеем дело с некой сложной инфекцией, сложно локализованной или возбудителем или какой-то внутрибольничной вспышкой. В некоторых госпиталях Минобороны очень долго не могли вывести сальмонеллёз, пока им не сделали фагов микрогеновцы, и этим препаратом они справились с многолетней проблемой, были довольны. Об этом рассказывал главный эпидемиолог Вооруженных сил. Вот так примерно.
Борис Долгин: Спасибо. Еще один вопрос: в косметической компании, дальше идет название, есть гель-бальзам с бактериофагами. Может ли он и подобные средства устранить причину воспаления, вредные бактерии, если да, то, как его правильно применять?
Андрей Летаров: Давайте начнем с конца – правильно применять путем намазывания на место воспаления. Может ли он устранить? Честно скажем, теоретически - да, на практике – вряд ли, поскольку я себе тяжело представляю изготовление и распространение этого бальзама, который бы действительно содержал эти бактериофаги в течение должного времени в должном количестве.
Борис Долгин: Спасибо. Есть еще третий вопрос, но он все-таки не имеет отношения к теме лекции.
Андрей Летаров: Да. Кто-то поставил эксперимент - он полгода не моется мылом, и что наука думает об этом? Наука не думает об этом плохо, она вообще об этом не думает.
Борис Долгин: Коллеги, еще вопросы?
Голос из зала: Еще один вопрос. Расскажите о процессе выделения бактериофагов, потому что процесс выделения микроорганизмов - относительно все понятно и просто, а с бактериофагами как? Какие-то чашки Петри засеваются какими-то культурами, и откуда-то берутся пробы – и?..
Андрей Летаров: Конечно. В принципе, это сильно зависит от того, бактериофага к которому микроорганизму мы хотим выделить. Если этот микроорганизм хорошо, нормально растет и на твердых, и на жидких средах, то это, конечно, сильно облегчит дело. Мы берем природный материал, где мы подозреваем наличие этого бактериофага исходя из экологии той бактерии, которая нас интересует и, например, сеем ее на среду с газоном бактерий. Если мы видим бляшки, то это очень хорошо, если мы не видим бляшек, можем поставить накопительную культуру в той жидкой среде, поместить там нашу бактерию и материал, содержащий природный штамм этой бактерии, и возможными бактериофагами поболтать - пускай там все это разрастается, и если есть фаги, они, може,т там вырастут, их концентрация увеличится, и мы потом супернатант этой культуры центрифугируем, осадок выкидываем. Светлое сверху – это супернатант, и это мы можем накапать на газон, и в каких-то разведениях если мы увидим бляшки, значит, выделили бактериофаг. Можно еще какие-то такие подходы придумать. Так примерно.
Голос из зала: Просто интересно - когда я занимался выделением, никогда ничего подобного не видел на культурах, и с какой вероятностью можно их терять, интересно.
Андрей Летаров: Это очень сильно зависит от конкретики. Если вы расскажете, что откуда вы выделяли, я могу попробовать посоветовать вам в частном порядке, как это улучшить, но я не то чтобы волшебник, я только учусь, и поэтому мои советы работают не всегда.
Борис Долгин: Последний вопрос.
Голос из зала: Скажите, а метагеномный подход позволил прочитать огромные кучи геномов бактерий, которые никогда не культивировались, а что насчет бактериофагов? Тоже верно?
Андрей Летаров: Да, метагеномный подход - это современно. Метагеномика бактериофагов… Я должен пояснить, что такое метагеномика. В случае бактериофагов это примерно так: мы берем, допустим, 200 литров океанской воды, концентрируем ее с помощью специальной установки фильтрации так, чтобы отделить плавающие фаги от бактерий, и получаем некий концентрат фагов, выделяем из них ДНК, ломаем её на мелкие кусочки и определяем последовательности большого количества этих самых мелких кусочков, чтобы судить о разнообразии бактериофагов, находящихся в исходном образце. Благодаря изобретению новых высокопроизводительных методов чтения последовательности ДНК типа пиросеквенирования и всяких прочих подходов такого рода, илюминовских технологий и так далее, можно получить феерическое количество данных о ДНК этих бактериофагов. Некоторые из присутствующих коллег, я даже подозреваю, лично этим занимались. И дальше можно сравнить - во-первых, попробовать некоторые кусочки склеить между собой, потому что если они перекрываются, их можно собрать в так называемые контиги – какие-то большие куски геномов бактериофагов восстановить отдельно, а дальше все это сравнивается с базами данных, но обычно в среднем 30-40% последовательностей из таких вирусных метагеномов из природных источников оказываются похожи на что-нибудь в базах данных, и ,как это ни удивительно, пока биологически осмысленной информации, которую можно из вирусных метагеномов извлечь, она бывает немного разочаровывающей. Эти выводы можно сделать намного проще и дешевле, но мне кажется, что тут есть определенные перспективы, можно попробовать сочетать морфологические и метагеномные исследования, в некоторых ситуациях можно пощупать наиболее представленные бактериофаги, потому что они могут, например, инфицировать бактерии, которые мы не умеем выращивать, их там много, а в лаборатории их нет. Зато мы можем как-то изучить и потом, например, с помощью прочих технологий типа ПЦРа отследить их биогеографию, динамику. Таких работ штук 20-30, по метагеномике фагов.
Борис Долгин: Спасибо большое.
Андрей Летаров: Спасибо за внимание.