Евгений Боткин — сын известного русского врача Сергея Боткина, лейб-медика императоров Александра II и Александра III. Принадлежал к старообрядцам-поповцам белокриницкого согласия.
Получил домашнее образование и в 1878 году, будучи 13 лет, был принят сразу в пятый класс 2-й Петербургской классической гимназии. После окончания гимназии в 1882 года поступил на физико-математический факультет Петербургского университета, однако, сдав экзамены за первый курс университета, ушёл на младшее отделение открывшегося приготовительного курса Военно-медицинской академии. В 1889 году окончил академию.
С января 1890 года работал врачом-ассистентом в Мариинской больнице для бедных. В декабре 1890 года на собственные средства командирован за границу для научных целей. Занимался у ведущих европейских учёных, знакомился с устройством берлинских больниц. По окончании командировки в мае 1892 года Евгений Боткин стал врачом придворной капеллы, а с января 1894 года вернулся в Мариинскую больницу сверхштатным ординатором.
8 мая 1893 году защитил в академии диссертацию на соискание степени доктора медицины «К вопросу о влиянии альбумоз и пептонов на некоторые функции животного организма», посвящённую отцу. Официальным оппонентом на защите был будущий Нобелевский лауреат Иван Павлов.
Весной 1895 г. был командирован за границу и два года провёл в медицинских учреждениях Гейдельберга и Берлина, где слушал лекции и занимался практикой у ведущих немецких врачей — профессоров Г. Мунка, Б. Френкеля, П. Эрнста и других. В мае 1897 г. избирается приват-доцентом Военно-медицинской академии.
В 1904 году с началом Русско-японской войны убыл в действующую армию добровольцем и был назначен заведующим медицинской частью Российского общества Красного Креста (РОКК) в Маньчжурской армии.
Осенью 1905 г. возвратился в Петербург и приступил к преподавательской работе в академии. С 1905 года — почётный лейб-медик. В 1907 году назначен главным врачом общины святого Георгия.
По просьбе императрицы Александры был приглашён как врач в царскую семью и в апреле 1908 г. назначен лейб-медиком императора Николая II. Пробыл в этой должности до своей гибели.
Являлся совещательным членом Военно-санитарного Учёного комитета при Императорской Главной квартире, членом Главного управления Российского общества Красного Креста. С 1910 года — действительный статский советник.
За несколько лет до своей кончины получил титул потомственного дворянина. Для своего герба он выбрал девиз: «Верою, верностью, трудом».
После падения монархии 2 марта 1917 года остался вместе с царской семьёй в Царском Селе, а затем последовал за ней в ссылку. В Тобольске открыл бесплатную медицинскую практику для местных жителей. В апреле 1918 года вместе с царской четой и их дочерью Марией был перевезён из Тобольска в Екатеринбург. Мог не ехать, но вызвался сам.
Был убит вместе со всей императорской семьёй в ночь на 17 июля 1918 года в Екатеринбурге в Ипатьевском доме. По воспоминаниям организатора убийства царской семьи Я. М. Юровского, Боткин умер не сразу — его пришлось «пристреливать».
