В последнем выпуске журнала Nature вышла статья израильских ученых о том, как бактериальный иммунитет – система CRISPR - отличает своих от чужих.
О системе CRISPR, защищающей бактерию от нападения бактериальных вирусов – фагов, в последнее время очень много говорят. Она была открыта совсем недавно, но сразу стало понятно, что, немного видоизменив, ее можно использовать для редактирования генома любых клеток. Подробнее об этом можно прочитать в специальных очерках «Редактирование генома: за и против» и «Новый шаг в редактировании генома».
Главные враги бактерий – фаги – вирусы, геном которых представлен молекулой ДНК. При заражении геном фага попадает внутрь бактерии и там интенсивно копируется, с него считывается РНК, бактериальные рибосомы вынуждены синтезировать вирусные белки, в конечном счете происходит сборка новых вирусов, которые покидают бактерию и отправляются на поиски новых жертв. Бактерия при этом часто гибнет.
В ходе эволюции у бактерий развился своеобразный иммунитет к фагам. Он был открыт во время исследования бактериальных геномов. В геномах бактерий нашлись кластеры, состоящие из фрагментов ДНК, совпадающих с фрагментами ДНК разных фагов. Оказывается, что бактерии умеют синтезировать РНК, частично комплементарную к ДНК фага и содержащую последовательность, привлекающую нуклеазу – белок, разрезающий нуклеиновые кислоты. Такая РНК по принципу комплементарности взаимодействует с ДНК вируса, к ним присоединяется одна из нуклеаз семейства Cas – Cas9, и режет вирусный геном. Вирус больше не может навредить бактерии, а информация о нем в виде фрагмента его ДНК сохраняется в бактериальном геноме. Как и в случае с приобретенным иммунитетом у человека, это позволяет быстрее давать отпор патогену при повторном заражении.
У человека обратной стороной существования иммунитета оказались становящиеся все более распространенными аутоиммунные заболевания. Они возникают, когда клетки иммунной системы принимают собственные клетки организма за патогены и атакуют их. Возникает вопрос, как от этого защищаются бактерии? Человеческий организм состоит из большого числа клеток, и, если иммунная система убьет некоторое количество, то последствия могут быть довольно неприятными и опасным (как, например, при сахарном диабете первого типа), но редко сразу смертельными. А вот у бактерии всего одна хромосома, и, если ее целостность будет непоправимо нарушена, бактерия погибнет. Это значит, что есть какой-то механизм, позволяющий системе CRISPR отличать собственную ДНК от ДНК патогена.
Сохранением фрагментов вирусной ДНК в собственном геноме у бактерий E. coli занимаются нуклеазы Cas1 и Cas2. Добившись избытка этих ферментов в бактериях, авторы статьи смогли за короткий срок получить широкий спектр обработанных и встроенных фрагментов ДНК. Проанализировав их, исследователи сделали несколько выводов.
Во-первых, чем интенсивнее реплицируется (удваивается) ДНК, тем больше у нее шансов попасть в «черный список» – кластер CRISPR. Бактериальная хромосома удваивается один раз за одно деление бактерии, а вирусная ДНК копируется гораздо чаще – попав в бактерию, вирус создает сразу много копий себя. Уже на этой стадии в CRISPR кластер попадает гораздо больше инородной ДНК, чем своей.
При анализе встроенных фрагментов оказалось, что значительная часть собственной ДНК, попавшей в память иммунитета, находится в одной и той же области – области конца транскрипции. Геном бактерий представлен одной кольцевой хромосомой, образованной двухцепочечной молекулой ДНК. Когда бактерия делится, геном реплицируется. Репликация бактериального генома начинается всегда в одной и той же точке, при чем идет сразу в двух направлениях: по часовой стрелке и против. У этого процесса довольно сложная геометрия, и в конце образуются две идентичных кольцевых молекулы, которые не связаны ковалентно, но сцеплены как звенья цепи. Чтобы они могли разойтись по дочерним бактериальным клеткам, их надо разделить. Для этого специальные ферменты - топоизомеразы – разрезают, разделяют и вновь сшивают цепи ДНК.
Иногда с восстановлением целостности ДНК возникают трудности. Разрывы ДНК вообще сравнительно часто возникают во время репликации (кроме того, они могут возникать под действием внешних неприятностей – например, радиоактивного излучения), но в области конца репликации происходят неизбежно. Если обычные ферменты репликации не справляются с их починкой, на помощь приходит еще один фермент, вернее, группа ферментов ответственная за устранение разрывов – RecBCD. RecBCD деградирует ДНК от места разрыва до так называемого χ-сайта (эти сайты разбросаны по геному), а потом начинает чинить.
Оказалось, что инактивация этих ферментов приводит к тому, что бактерия перестает отличать свою ДНК от чужой, и в CRISPR кластер начинает попадать больше бактериальных последовательностей. Кроме того, добавление в чужеродную ДНК χ-сайтов существенно сокращало их попадание в кластеры CRISPR.
Из всего этого складывается стройная концепция. В CRISPR кластер попадают преимущественно фрагменты ДНК, отделенные во время деградации с участием RecBCD. Поскольку бактериальная ДНК будет деградировать до ближайшего χ-сайта, а чужеродная гораздо дольше – чужеродной ДНК попадает в кластеры больше. Значительная часть разрывов в ДНК, из-за которых RecBCD запускают деградацию, происходит во время репликации, поэтому та ДНК, которая чаще реплицируется, чаще попадает в кластеры. А это опять-таки вирусная ДНК. Таким образом, вирусную ДНК выдают отсутствие χ-сайтов и скорость репликации.
