Лауреатов Нобелевской премии 2018 года по химии трое. Половину премии получила Фрэнсис Арнольд (Frances H. Arnold) из Калифорнийского технологического института, а вторая половина разделена между Джорджем Смитом (George P. Smith) из Университета Миссури и Грегори Винтером (Sir Gregory P. Winter) из Лаборатории молекулярной биологии в Кембридже.
Работы всех этих исследователей связаны с созданием биологически важных белков, например, ферментов или антител, обладающих нужными свойствами. При этом ученый не напоминает в этом процессе конструктора, собирающего устройство из составных частей, а моделирует естественную эволюцию, в ходе которой возникают различные варианты и сохраняются наиболее успешные из них.
Фрэнсис Арнольд считается основательницей направления, получившего название «направленная эволюция белковых молекул». В ее лаборатории работали над созданием новых, более эффективных ферментов, и Фрэнсис Арнольд решила использовать для этого тот же метод, что использует сама природа. Ведь природа, как часто говорит Арнольд, не конструирует белки, а создает множество вариантов, из которых отбираются самые удачные.
Для направленной эволюции ферментов в ген нужного фермента вносятся случайные мутации, затем из полученных вариантов отбираются те, что лучше всего соответствуют поставленной задаче (при экспрессии данного гена получается наиболее функциональный фермент). В эти гены вновь вносятся мутации, и цикл повторяется многократно до достижения цели.
Принципиальная схема направленной эволюции белков
Вероятность успеха в этом деле напрямую зависит от количества измененных вариантов гена, которые задействованы в отборе (так называемой «библиотеки вариантов гена»). Ведь чем их больше, тем выше шансы, что среди них найдутся самые удачные. Обычно число вариантов достигает миллионов или миллиардов. Исходный ген подвергают точечным мутациям при помощи химических мутагенов или намеренного внесения ошибок при полимеразной цепной реакции, также в него могут вставлять или наоборот удалять участки нуклеотидной цепочки при помощи транспозонов – особых участков ДНК, способных перемещаться по геному.
Большинство вариантов, возникших в результате мутации, ведет к уменьшению эффективности гена, и исследователям нужно отобрать те немногие, которые оказались удачными. Для этого можно поместить плазмиды, содержащие эти гены, в живые клетки. Обычно для этого служат культуры бактерий или дрожжей. Затем замеряется экспрессия ими нужного белка.
Существуют методы оценки без использования живых клеток. Тогда транскрипция и трансляция гена и получение нужных РНК и белка проводятся в растворе или в искусственных микрокапельках. Такие методы позволяют легче проводить отбор по ряду факторов (например, температура или растворимость), а также создавать белки, которые токсичны для живых организмов.
Метод направленной эволюции уже помог создать новые лекарства, например, ситаглиптин – средство от диабета второго типа, для производства которого используется искусственно созданный фермент. Другие ферменты могут создавать топливо из возобновляемых источников. Одной из работ, в которых лично участвует Фрэнсис Арнольд, стало создание фермента, позволяющего получить изобутанол. В перспективе изобутанол может стать биотопливом, которое придет на смену бензину.
Джордж Смит и Грегори Винтер создали метод фагового отображения («фагового дисплея») белков. Для него используются бактериофаги – вирусы, поражающие бактерии. Например, если нужно установить, какой белок кодируется определенным геном, исследователь вставляет этот ген в геном бактериофага, точнее – в ту его часть, что отвечает за синтез белковой оболочки вируса. Тогда в оболочке получившегося бактериофага будет присутствовать данный белок.
Установлением связи гена с белком возможности фагового отображения не исчерпываются. Полученные в ходе работы бактериофаги с нужным белком в оболочке можно использовать для изучения взаимодействия этого белка с другими белками, пептидами или с молекулами ДНК.
Фаговое отображение можно применять в качестве варианта направленной эволюции белков. Создав библиотеку вариантов гена с помощью того или иного способа внесения мутаций, затем можно все эти варианты засунуть в геномы бактериофагов и использовать эти бактериофаги для отбора.
В частности так можно модифицировать антитела для лечения каких-нибудь заболеваний. Именно такую работу проделал Грегори Винтер. Первым лекарством, при создании которого были применены фаговое отображение и направленная эволюция, стал адалимумаб – средство, одобренное в 2002 году для лечения ревматоидного артрита, псориаза и воспалительных заболеваний кишечника.
