Ученые из Института биохимии имени А. Н. Баха ФИЦ биотехнологии РАН и Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова получили стабильный и яркий флуоресцентный белок moxSAASoti, способный менять окраску и интенсивность собственного свечения. Для этого они точечно изменили последовательность кодирующего его гена. Ранее все белки, способные «переключать» цвет, были очень чувствительны к окислению и переставали светиться, тогда как новый вариант молекулы не теряет своих свойств. О работе рассказала пресс-служба Российского научного фонда.
Флуоресцентные белки представляют собой молекулы, которые при облучении светом с определенной длиной волны способны сами светиться. Их выделяют из живых организмов, например медуз и кораллов, или искусственно синтезируют в лабораториях. На сегодня существует множество флуоресцентных белков, различающихся по цвету и интенсивности излучения, а также по вариантам изменения окраски. Некоторые из них просто переходят из флуоресцентного состояния в нефлуоресцентное, то есть перестают светиться, а другие способны менять цвет излучения с зеленого на красный. Этот процесс протекает, когда белок облучают светом определенной длины волны. Он может быть обратимым и необратимым. Некоторые флуоресцентные белки способны изменять цвет свечения только один раз, что происходит в результате разрыва химических связей. В этом случае структура вещества полностью нарушается и не восстанавливается самостоятельно. Однако есть исключения — например, белок SAASoti, который способен многократно изменять интенсивность своего свечения (включаться-выключаться) и переходить из зеленой формы в красную. Однако SAASoti имеет недостаток: он очень чувствителен к окислителям, которые нарушают его структуру. Например, он окисляется даже на воздухе, что объясняется высокой фотохимической активностью входящих в его состав аминокислотных остатков цистеина.
Авторы работы с помощью мутаций в гене SAASoti создали варианты флуоресцентного белка с минимальным содержанием цистеина и даже вовсе не несущие его. Для этого авторы получили ДНК с нужными заменами и затем ввели ее в клетки кишечной палочки E. сoli. Таким образом микроорганизмы получили ген, кодирующий белок SAASoti, и синтезировали на его основе белки, отличающиеся от исходных по строению. Каждая из вводимых мутаций приводила к интересному изменению свойств белка. Так, например, одиночные точечные мутации вызвали его обесцвечивание, а в результате двухточечного мутагенеза был получен ряд белков с различной степенью яркости окраски. При этом исследователи с помощью математического моделирования могли предварительно предсказать влияние конкретной мутации на свойства белка.
В результате экспериментов было выявлено, что самые благоприятные положения для мутаций — 105 и 117 аминокислота. Соответствующие белки очистили и сравнили между собой по интенсивности окраски, скорости ее изменения, устойчивости к факторам окружающей среды и по другим физико-химическим свойствам. Так, при длине света 520 нанометров наиболее ярким оказался вариант, содержащий в 117 положении аминокислоту треонин, — белок moxSAASoti-T. Кроме того, он в восемь раз быстрее, чем другие варианты, менял цвет.
«Полученный нами флуоресцентный белок moxSAASoti-T имеет уникальные, не характерные для других белков свойства, такие как высокая устойчивость к окислителям, быстрое и обратимое изменение интенсивности свечения и окраски. Он может быть использован в современной микроскопии, например в области нейробиологии, для изучения поведения белков в различных условиях среды. Бифотохромные свойства, то есть способность изменять цвет свечения, делают moxSAASoti-T интересным объектом для дальнейших исследований», — рассказывает профессор Александр Савицкий, заведующий лабораторией физической биохимии Института биохимии имени А. Н. Баха ФИЦ биотехнологии РАН.
Результаты исследования, поддержанного грантом Российского научного фонда, опубликованы в журнале Scientific Reports.
