Генная терапия сделала шаг в направлении лечения β-талассемии и заболеваний, вызванных конкретной мутацией в единственном гене. Соответствующая работа опубликована в журнале Genome Research группой ученых из Калифорнии. Ученые получили индуцированные плюрипотентные стволовые клетки из клеток пациента, отредактировали их геном и заставили дифференцироваться в клетки крови.
β-талассемия – генетическое заболевание крови, вызываемое мутациями в гене, кодирующем одну из частей гемоглобина. Когда мутации оказываются в обеих копиях гена, болезнь может протекать очень тяжело. Лечения как такового не существует, только переливания крови и пересадка костного мозга, если удастся найти донора. Медикаментозное лечение направлено на то, чтобы снизить токсичность свободного железа, которое у здоровых людей находится в связанном состоянии в молекуле гемоглобина.
Выживают больные с мутациями, из-за которых полностью прекращается синтез гемоглобина, благодаря эмбриональному гемоглобину – это другая, менее эффективная разновидность, которую кодирует другой ген. У здоровых людей ее уровень ее синтеза быстро падает после рождения, хотя и не до нуля.
Так как β-талассемия относится к моногенным заболевания – тем, которые вызываются мутацией в единственном гене, – она кажется перспективной мишенью для генной терапии. Включил нужный ген в нужном месте – и пациент здоров. Дело за малым – придумать, как включить.
Самый эффективный на сегодняшний день метод – это вирусная доставка нужного гена. Создается специальный вирус, неспособный никого заразить больше одного раза и вместо генов, которые кодировали бы его собственные вирусные белки, содержащий терапевтические гены. Этим вирусом заражаются клетки. Сейчас один человек после лечения такими вирусами живет с генотипом, соответствующим тяжелой форме β-талассемии, но без переливаний крови и нормально себя чувствует.
Вирусная доставка терапевтических генов, однако, вещь эффективная, но опасная. Во-первых, вирус может встраивать свою ДНК в произвольное место генома. Это может нарушить работу какого-нибудь нужного клетке гена и привести к нежелательным последствиям, вплоть до превращения клетки в раковую. Кроме того, человеческий организм приучен бороться с вирусами, и при введении большого количества вирусных частиц возникает иммунный ответ, иногда довольно тяжелый. Поэтому возникает вопрос, нельзя ли отредактировать геном как-нибудь побезопасней.
В генной инженерии вовсю применяются эндонуклеазы рестрикции – ферменты, которые у бактерий играют роль иммунной системы. У бактерий есть свои вирусы, они называются бактериофаги. Они точно также как обычные вирусы, чтобы размножиться, должны заразить бактерию и встроить свой геном в геном бактериальной клетки. Поскольку для бактерий это смертельно опасно, они защищаются. У них есть ферменты, которые узнают небольшие последовательности ДНК бактериофага (аналогичные последовательности у самих бактерий предусмотрительно химически модифицированы и недоступны для ферментов) и разрезают ее. Для некоторых таких ферментов последовательности («сайты узнавания») строго определены и, как правило, состоят не более чем из 10 пар оснований. Это очень удобно для ученых, которым в лаборатории надо редактировать, сшивать и склеивать небольшие участки ДНК – там удается подобрать ферменты, сайты узнавания которых встречаются в редактируемой ДНК 1-2 раза. Весь геном, однако, гораздо больше: геном человека – это 3 миллиарда пар оснований, а в лабораториях чаще всего имеют дело с плазмидами и вирусами – это, максимум, несколько десятков тысяч пар оснований. Теория вероятности подсказывает, что конкретное произвольное «слово» из восьми букв встретится в геноме около 50 тысяч раз. Если редактировать геном таким инструментом, от него ничего хорошего не выйдет, а только разлетятся клочки по закоулочкам, и клетка быстро погибнет, не в силах починить все разрывы.
На радость ученым у бактерий нашелся еще один метод защиты от бактериофагов – это CRISPR/CAS9. Это тоже своеобразная «иммунная система» бактерии. Она функционирует благодаря коротким последовательностьям в ДНК бактерии, соответствующим фрагментам из ДНК бактериофагов. Собственно, CRISPR означает «Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats» – короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами. С этих фрагментов ДНК бактериофага бактерия синтезирует цепочки РНК. РНК взаимодействует по принципу комплементарности с ДНК бактериофагов, проникающих в бактериальную клетку, а пока они взаимодействуют, специальные белки вносят разрыв в ДНК в месте взаимодействия. В данном конкретном случае эту функцию выполняет белок CAS9. Похожий метод инактивации генов есть и у более сложно устроенных организмов, вплоть до человека. Он называется РНК-интерференцией (Почитать о роли РНК-инференции можно тут и тут).
Это явление научились использовать в своих интересах ученые. Можно синтезировать РНК, комплементарные тому месту, куда хочется внести разрез, и похожие на РНК из системы CRISPR/CAS9 и ввести их в клетки вместе с белком CAS9. На самом деле, конечно, в клетки вводятся конструкции из ДНК, кодирующие и то, и другое. РНК будет указывать на то место, где надо резать, а белок – резать. Комплементарная часть таких РНК как правило составляет около 20 оснований, вероятность встретить в геноме конкретное «слово» длиной 20 букв составляет примерно 0,003, поэтому легко подобрать РНК, комплементарную единственной нужной последовательности генома.
Внесение разрыва в двухцепочечную геномную ДНК сильно повышает вероятность гомологической рекомбинации – процесса, при котором гомологичные хромосомы могут обмениваться гомологичными фрагментами. Если ввести в клетку донорную ДНК, несущую нормальный ген гемоглобина, а затем с помощью системы CRISPR/CAS9 ввести разрыв в нужное место, то с определенной довольной высокой вероятностью образуется хромосома с нормальным геном.
Все это авторы статьи проделали с iPS клетками – плюрипотентными клетками, полученными из соматических клеток самого пациента (об iPS клетках можно прочитать здесь и здесь). Поскольку материалом служат клетки самого пациента, можно не беспокоиться об иммунном ответе после трансплантации клеток обратно. Затем клетки дифференцировали в эритробласты – еще пока содержащие ядро предшественники эритроцитов и оценивали в них уровень синтеза гемоглобина. Оказалось, что он возрастал. Однако еще быстрее возрастал уровень синтеза эмбриональной разновидности гемглобина, за счет которой как раз и выживают больные β-талассемией.
Авторы говорят, что после доработки метода дифференцировки во взрослые эритробласты, их метод будет применим для лечения людей. В любом случае, предложен еще один, довольно эффективный метод редактирования генома, который может пригодиться для лечения самых разных болезней.
