Ученые из Московского физико-технического института, Университета Стоуни-Брука (США), Лаборатории Колд Спринг Харбор (США) и Института биологии развития имени Кольцова РАН (часть работы проводилась на базе Курчатовского института) научились помечать делящиеся стволовые клетки тремя разными метками, ранее можно было одновременно использовать максимум две метки. Новый способ повысит точность и скорость анализа деления стволовых клеток. В статье, опубликованной в Stem Cell Reports, ученые продемонстрировали, что с помощью тройной метки можно изучать размножение стволовых клеток в разных тканях. Кратко о результатах работы сообщает пресс-релиз МФТИ.
«Реинкарнация» клеток
Во многих тканях и органах обнаружены стволовые клетки, которые обеспечивают восстановление тканей. Даже во взрослом мозге, вопреки расхожему заявлению, что нервные клетки не восстанавливаются, есть области, где происходит так называемый нейрогенез — развитие новых нейронов. Считается, что нейрогенез играет важную роль в обучении и памяти, реакции на стресс и регенерации поврежденной нервной ткани. Обычно регенерация тканей происходит следующим образом: стволовые клетки делятся, часть из них продолжает делиться, возобновляя запас стволовых клеток, а часть — дает начало новым взрослым клеткам. В разных тканях этот процесс протекает по-разному, задача ученых — выяснить, как именно он протекает и как на это могут повлиять разные факторы. Чтобы узнать, сколько делений проходят стволовые клетки в той или иной ткани, какова длина клеточного цикла, куда перемещаются новорожденные клетки и во что они превращаются, нужен способ за ними наблюдать.
Рисунок: цикл клетки. Во время фазы G1 происходит подготовка к делению, содержимое клетки, кроме ДНК, удваивается. Во время фазы S с ДНК «снимается копия» — молекулярная машинерия строит дочернюю ДНК по образу и подобию ДНК клетки. G2 — конечный этап подготовки к делению, то есть к митозу (М). Во время фазы G1 клетка может сойти с цикла и перейти в фазу покоя G0, то есть перестать делиться. Иллюстрация пресс-службы МФТИ
Нечерная метка
Когда в делящейся клетке происходит удвоение ДНК, можно обмануть систему и подсунуть ей меченый «кирпичик» для дочерней ДНК. Для этого в организм вводят аналог тимидина, одного из четырех «кирпичиков», из которых состоит ДНК, и этот аналог встраивается в дочернюю ДНК вместо тимидина. Остальные «кирпичики» участвуют во многих других реакциях в клетке, поэтому для того, чтобы пометить только новосинтезированую ДНК, используют аналоги именно тимидина. В момент введения аналога тимидина помечаются только те клетки, которые находятся в S-фазе клеточного цикла, потому что именно во время этой фазы происходит удвоение ДНК. Причем когда помеченная клетка поделится и даст потомство, оно тоже будет помечено. Далее ученые могут взять ткань на анализ и обнаружить метки с помощью флюоресцентных антител.
Антитела — это белки, которые вырабатываются клетками иммунной системы, распознают чуждые организму молекулы и садятся на них. Антитела избирательно связываются со своими мишенями, и это свойство широко используется в биологии и медицине. Так, с помощью флюоресцентных производных антител можно распознавать определенные компоненты внутри организмов
Таким образом можно проследить за судьбой клеток, которые во время вкалывания метки были в S-фазе. В принципе, это можно сделать с помощью одной метки на нескольких группах мышей. Например, первую группу взять на анализ через 2 часа после ввода метки, вторую — через 24, третью — через 48 часов, а затем увидеть, где оказались меченые клетки и понять, как они перемещались. Однако в таком случае нужно слишком много мышей, да и точность страдает: мы следим за клетками не в одном организме. Если есть несколько разных меток, то можно ввести их в разные промежутки времени в одно животное. До настоящего момента ученым было доступно максимум двойное мечение. Но чтобы определить самые важные параметры с помощью двойной метки, все равно требуется много времени и несколько групп животных.
Сила трех
Метки, в качестве которых используются аналоги тимидина, распознаются с помощью антител. Но антитела не идеальны и могут связываться не только со «своей» мишенью, но и с похожей. Если одни и те же антитела садятся и на одну, и на другую метку, то их невозможно будет различить. Из-за того, что аналоги тимидина похожи и в большинстве случаев антитела их путают, до недавнего времени можно было использовать только две метки. Не так давно появился новый аналог тимидина, который можно выявлять не антителами, а с помощью так называемой клик-химии, когда присоединение флюоресцентного красителя происходит путем химической реакции. Проблема этого красителя была в том, что при тройном маркировании он оставлял «непрокрашенные» области, на которые садились антитела против двух других меток, в результате чего метки нельзя было различить. Однако ученые нашли способ закупорить эти области — с помощью родственного к красителю, но бесцветного вещества.
Фото: кишечник — голубым окрашена первая метка; зеленым — метка, введенная через 24 часа после первой; красным — через 24 часа после второй; белые клетки — это клетки в любой фазе цикла, кроме G0 (т. е. клетки, участвующие в делении). Фото автора исследования
Ученые испробовали метод тройного мечения на стволовых клетках мозга, кишечника и семенников. Наиболее наглядный результат получился на кишечнике: метки, введенные в разное время, распределились в соответствии с известными данными о перемещении клеток в кишечнике. Кроме того, с помощью тройной метки получилось с высокой точностью определить новые важные параметры нейрогенеза. Таким образом, авторы статьи разработали инструмент для исследования стволовых клеток в любой ткани, который превосходит предыдущий по точности и ускоряет и облегчает получение результата.
Старший научный сотрудник лаборатории стволовых клеток мозга МФТИ и один из авторов статьи Олег Подгорный комментирует: «Мы сейчас широко используем тройную метку в анализе нейрогенеза мышей при различных воздействиях: радиационном воздействии, диете, применении различных лекарств, в том числе и противоопухолевой терапии. Кроме того, мы применяем эту технологию для того, чтобы проверить, как влияют на нейрогенез те вещества, которые используются для лечения болезни Альцгеймера и других заболеваний нервной системы. При болезни Альцгеймера у человека снижаются когнитивные способности и память, и на сегодняшний день накопилось достаточно много данных, свидетельствующих о том, что нейрогенез очень важен для осуществления этих функций мозга».
Расчет доли клеток, вернувшихся в цикл. Клетки помечают первой меткой, через 4 часа помечают второй меткой, через 19 часов после второй метки помечают третьей меткой и ещё через час берут на анализ. Клетки, помеченные метками 1 и 3, вернулись в цикл, а помеченные только меткой 1 — вышли из цикла. Анимация сделана пресс-службой МФТИ.
