Живая природа насыщена красками, радующими глаз и вызывающими неиссякаемый интерес ученых. Какие структуры и молекулы определяют окраску? Какова ее биологическая роль? Можно ли использовать эти знания на практике?
Обнаруженный у медуз зеленый флуоресцентный белок спровоцировал настоящую технологическую революцию в биологии. Еще в 1990-е годы ученые научились использовать его как «маячок», позволяющий изучать и визуализировать множество процессов в живой клетке.
Константин Лукьянов рассказывает, у каких морских созданий есть флуоресцентные белки и как их можно ввести в модельные живые системы.
Лектор: Константин Лукьянов, профессор Сколковского института науки и технологии, доктор биологических наук, член-корреспондента РАН.
Модератор: Борис Долгин.
Лекция вышла в рамках проекта «Лекторий Cколтеха на Полит.ру».
Лукьянов: Большое спасибо за приглашение, рад поучаствовать в этом мероприятии. Отвечая на вопрос, зачем это исследовать, в данном случае можно сказать: «Ну, во-первых, это красиво!» Я работаю сейчас в Сколковском Институте науки и технологий, также на полставки в Институте биоорганической химии, где я и провел предыдущие 25 лет, и здесь же было сделано большинство тех работ, которые я дальше буду обсуждать.
Начну со странного: сначала скажу, о чем мы не будем говорить, а именно — о биолюминесценции. Люди часто путают флуоресценцию и биолюминесценцию — ну, потому что и про то, и про другое часто говорят «светится». Но это разные явления.
Биолюминесценция — это именно свечение в темноте за счет химических реакций окисления. Это всегда окисление, в самом общем виде можно ее представить как некую субстанцию «люциферин», которая окисляется кислородом с участием фермента люциферазы, и в результате этой реакции получаются фотоны света. Это явление чрезвычайно распространено в природе, от грибов до насекомых, чрезвычайно много морских организмов биолюминесцирует. Только в растениях нет биолюминесценции. Но недавно в нашем институте лаборатория Ильи Ямпольского сделала первые люминесцентные растения, но это искусственно, не природное явление. Эти системы возникали множество раз в эволюции, более сорока раз, это совершенно разные системы, объединенные только функциональным выходом света. Это огромная прекрасная тема, которая достойна отдельной лекции, и дальше я не буду ее касаться, а будем мы говорить про флуоресценцию.
Флуоресценция — это переизлучение света. Чтобы увидеть флуоресценцию, вам надо сначала посветить каким-то источником света на изучаемый объект. Это может быть ультрафиолетовый фонарик или еще какой-то свет. Но в данном случае это уже не химическая реакция, а переизлучение света, привнесенного в систему. Таких примеров в природе тоже достаточно много, хотя, наверное, меньше, чем биолюминесценции. Иногда — довольно неожиданные, вот флуоресценция скорпионов, например, не так очевидна. Рыбы некоторые флуоресцируют, черви и некоторые организмы, которые мы дальше будем подробно рассматривать.
Поскольку лекция общая, я хочу очень коротко остановиться на том, какими классами органических веществ, полимеров, мы обладаем в нашей живой клетке. Это всем, наверное, известная ДНК, РНК, белки, вокруг которых будет, в основном, строиться доклад, ну, и также есть липиды, сахара (или углеводы) и витамины. Всё это более-менее понятные широкой публике вещества.
Зачем они нужны? В очень общих словах, основные функции: ДНК — это хранение генетической информации, это наш геном, как библиотека; РНК позволяет выражать эту генетическую информацию, реализовывать, считывать; липиды делают клеточные мембраны; а вот белки — они фактически делают всё в живой клетке, это такие «универсальные солдаты», которые, как человечки, участвуют во всех-всех процессах, и поэтому они, на мой взгляд, наиболее интересны; углеводы дают питание; витамины и кофакторы — это вещества, которые помогают белкам делать разные важные вещи.
Если мы вернемся к окраске — флуоресценции, в частности, и просто к окраске, — оказывается, что среди всех этих веществ окрашены только витамины и всякие кофакторы. Ни белки, ни нуклеиновые кислоты сами по себе не несут цвета, то есть мы не можем их видеть. И предмет сегодняшней лекции — флуоресцентные белки, в частности, зеленый флуоресцентный белок, который сокращается в GFP (green fluorescent protein), — это единственное семейство окрашенных белков, которые сами по себе окрашены, без привлечения вот этих внешних кофакторов. Это делает их уникальными как в плане фундаментального изучения, так и в плане применения.
Вся история началась довольно давно, хотя, по меркам большой науки, не очень. В 1962 году был открыт белок GFP (green fluorescent protein), из медузы Aequorea victoria. Это гидроидные медузы, не совсем обычные — не те, к которым мы привыкли (мы обычно видим сцифоидные медузы), они поменьше. Тем не менее это относительно большая гидроидная медузка. И в 1962 году Осаму Шимомура открыл этот белок, но на уровне белка. То есть в течение следующих тридцати лет этот белок немножко изучали, но в руках было только немножко белка, выделять из биомассы медузы его было довольно сложно. В 1990-х гг. произошла революция: сначала клонировали ген этого белка и потом довольно быстро поняли, что его можно применять в биотехнологических системах. И дальше пошло взрывное развитие этой темы. В 1999–2000 гг. мы в Институте биоорганической химии подключились к этой теме, и мои коллеги нашли разноцветные флуоресцентные белки. В 2008 году за открытие и применение GFP дали Нобелевскую премию Осаму Шимомуре, Мартину Чалфи и Роджеру Циену (Osamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger Tsien).
На первый взгляд, ничего зеленого в этой медузе нет. И действительно, разглядеть это сложно. Она прозрачная, но если посмотреть люминесценцию или флуоресценцию, она происходит в виде таких точечек, пятнышек, в специальных местах — в тех местах, где крепятся щупальца к куполу медузы. Поэтому многочисленные картинки, которые можно видеть в Интернете и даже в довольно солидных изданиях, когда целиком медуза окрашена зеленым, особенно вообще не того класса, — это всё неправда. Это происходит оттого, что люди знают, что есть зеленые медузы, видят фотографию какой-то такой прозрачной медузы и думают, что, наверное, это сфотографировали плохо, и перекрашивают.
Как я уже сказал, в конце 1990-х лаборатория Сергея Лукьянова с коллегами из других институтов подключилась к этой теме по гениальной идее Юлия Александровича Лабаса: он посоветовал нам искать флуоресцентные белки в коралловых полипах, а не в медузах, чем занимался перед этим весь мир. И благодаря, с одной стороны, удаче, с другой стороны — высокому профессионализму, в частности, Михаила Матца и Аркадия Фрадкова, были клонированы первые флуоресцентные белки из коралловых полипов. Они были не биолюминесцентные. Тогда, на тот момент, было непонятно, что это флуоресцентные белки той же группы, что GFP, который участвует в биолюминесценции.
Это открытие было очень заметно на мировом уровне, это называли «Второй красной революцией из России», и практически все красные флуоресцентные белки, которые на сегодня есть и используются, тем или иным образом вышли из этой работы.
Чем мне нравится тема флуоресцентных белков: тут есть и природная составляющая, когда мы можем изучать эти белки. Это явление как оно есть в природе, с точки зрения просто фундаментальной науки. Вторая часть моего рассказа будет про то, как это можно использовать.
Я давно уже такие лекции студентам рассказываю. Поскольку в названии «флуоресцентные белки» не стоит ударение, я любил пошутить: «Что такое флуоресцентные бе́лки или белки́? Вообще не очень понятно». И каково было мое изумление, когда в прошлом году оказалось, что есть-таки флуоресцентные бе́лки. Это белки-летяги: если на них посветить ультрафиолетовым светом, оказывается, что шерстка у них флуоресцирует таким красным, дальне-красным светом. Но это никак не связано, честно говоря, с флуоресцентными белками, это светятся пигменты порфирины, которые у них почему-то накапливаются в шерстке. Тем не менее есть, оказывается, флуоресцентные бе́лки. Но дальше мы про них не будем говорить.
Если говорить о настоящих флуоресцентных белках, то их распределение по эволюционному дереву довольно странное, я бы сказал, не очень обычное. Во-первых, они есть только в животных, флуоресцентных белков нет в бактериях, археях, в растениях, грибах — никаких намеков на них. Но если взять эволюционное дерево животных, то они есть, с одной стороны, в кишечнополостных (это гидроидные медузы и коралловые полипы), а с другой — в довольно высокоорганизованных животных, а именно в ракообразных, которые принадлежат к типу членистоногих, а также даже в низших хордовых: это ланцетник (брахиостома — это ланцетник), такие червячки, но на самом деле это низшие хордовые, практически ближайшие предки позвоночных.
И такое распределение говорит о том, что либо был горизонтальный перенос — то есть, например, эти гены возникли у кишечнополостных, а потом рачки и хордовые их съели и каким-то образом акцептировали, либо вторая модель — что они возникли когда-то очень давно, очень рано в эволюции животных, в самых первичных предках, еще до разделения этих ветвей, и таким образом эволюционировали.
Надо отметить, что во многих-многих животных GFP нет совсем, то есть нет никаких остатков, никаких намеков. Включая и человека, и муху, и мышь, и так далее. Как это всё развивалось, не очень понятно.
Вот здесь пятнышками отмечены цвета, которые бывают (по крайней мере, известны) в разных группах. Видно, что коралловые полипы наиболее разнообразны по цветам: бывают синие, зеленые, желтые и красные флуоресцентные белки, и вот такие окрашенные малиновые. Они часто малиновые или синие — белки, которые окрашенные, но не флуоресцируют. В других группах поменьше цветовое разнообразие, но оно тоже есть.
Дальше я несколько картинок хочу показать, как это выглядит вживую. Может быть, кто-то нырял на коралловых рифах или хотя бы видел их в аквариумах, это можно даже в Москве сделать. Вся эта окраска, которая не бурая, а такая разноцветная, типа малиновой, — это благодаря флуоресцентным или окрашенным белкам семейства GFP.
Зеленые и красные флуоресцентные белки очень красиво распределены по поверхностям коралловых полипов, явно как-то неслучайно. Функции их во многом непонятны, поэтому это разнообразие цветов и паттернов окраски до сих пор остается не очень понятным. В любом случае, красивое явление. Этих белков очень много, и кораллы явно зачем-то их экспрессируют в большом-большом количестве.
Можно посмотреть на кораллы под микроскопом и увидеть это внутриклеточное распределение. Оно бывает довольно интересное. Например, в коралле Zoanthus мы нашли кристаллы даже флуоресцентных белков, прямо в живых клетках образуются кристаллические, выпадают в осадок фактически кристаллы флуоресцентных белков или вот такие агрегаты. Их много, они прямо кристаллизуются. Где-то можно видеть, как флуоресцентные белки окружают клетки водорослей, которые внутри сидят, — это эндосимбионты, которые фотосинтезируют и таким образом питают кораллы. И, возможно, это важное сотрудничество флуоресцентных белков, которые их, например, экранируют от излишнего света, и одноклеточных водорослей.
Не только Aequorea — многие другие гидроидные медузы несут зеленые флуоресцентные белки. Иногда они состоят не из одного белка на уровне гена, но и из белка из четырех разных доменов, почти одинаковых. Какая-то произошла в эволюции дупликация, так что это всё — один белок, как четыре флуоресцентных белка, соединенных между собой.
Разные медузки, вот предлагают по ним даже уточнять классификацию: поскольку паттерны разные, вы можете легче определять вид конкретной медузы, что бывает довольно сложно.
Вот такой красивый случай, когда гидроидные полипы сидят на моллюсках, на ракушках и, как фонарики разноцветные, освещают это всё.
Вот тут — просто интересные сифонофоры. Это тоже гидроидные полипы, только они колониальные, то есть они образуют колонии из многих полипчиков и таким образом плавают. В данном организме были обнаружены двухдоменные флуоресцентные белки, каждый из них — как GFP. Аминокислоты кодируются, то есть обозначаются буквами латинского алфавита. Здесь двадцать букв, соответствующие двадцати аминокислотам, которые встречаются в белках. Вот они здесь записаны. И когда мы посмотрели на линкер (он подчеркнут в статье, поэтому легко посмотреть), там было написано: «VAMPRIVET». Вот как хотите, так и понимайте. Передали привет нам, откуда — непонятно, в линкере между флуоресцентными белками.
Ланцетники слева — это те самые низшие хордовые, о которых я говорил. Тут тоже интересные паттерны: жабры светятся, хвостик светится. На самом деле, флуоресцирует, а не светится. Проявляет флуоресценцию. На мой взгляд, очень интересный случай — это копеподы, маленькие рачки, их очень много плавает в океане, далеко не все они флуоресцентные, но некоторые группы несут флуоресценцию. Вы видите разные виды рачков, очень по-разному окрашенных, и, в отличие от всех других организмов, которые мы перед этим рассматривали, они потенциально могут увидеть собственные флуоресцентные белки: у них есть глаза (вот здесь видно точки такие черные, ну, и вот здесь тоже), которые способны строить изображение, и потенциально такие паттерны флуоресценции могут быть использованы этими рачками, например, для того, чтобы распознавать особей своего вида.
Биологические функции FP, флуоресцентных белков, почти не изучены. Очень трудно изучать, не очень это важная насущная проблема, и поэтому всё, что можно определенно сказать, — что их довольно много разных на сегодня, и большинство из них неизвестные или как минимум недоказанные. То есть как минимум предположить можно, но четкие экспериментальные доказательства получить довольно сложно.
Какие это функции? Первая — это участие в биолюминесцентных системах. Это можно считать доказанным. Так же, как в первой открытой флуоресцентной системе — вот медуза Aequorea victoria, и вот флуоресцентные эти гранулы по краю, — в этих организмах и некоторых других GFP является частью биолюминесцентных систем. То есть люцифераза или фотобелок (акварин в данном случае) производит свет в темноте, но он не сразу излучается в пространство, а переносится на флуоресцентный белок и уже после этого переизлучается другим цветом, и часто более эффективно, в окружающую среду.
Другой вопрос — зачем это нужно. Не всегда понятно, но в целом это ведет к увеличению яркости и к тому, что, в целом, зеленый свет лучше виден на фоне голубой воды. Есть такая точка зрения, что контраст этой вспышки, которая должна быть увидена кем-то, возрастает.
Эта функция — это хорошо, но большинство видов с флуоресцентными белками не биолюминесцирует. Поэтому этой функцией мы ограничиться не можем, нужно предлагать что-то еще. Другая функция, предложенная в 2000 году, заключается в том, что флуоресцентные белки позволяют как-то играть со светом для эндосимбиотических водорослей, от которых кораллы очень сильно зависят. Большинство видов кораллов несет в себе эти одноклеточные водоросли (в данном случае мы их видим как красные такие кружочки). И избыток света для них тоже вреден. И поэтому при избытке света, как утверждается в этой гипотезе, флуоресцентные белки экранируют. А при недостатке они, наоборот, мигрируют вниз, под водоросли, и как минимум не мешают, а как максимум — переизлучают свет и дают возможность водорослям опять фотосинтезировать за счет этого света.
У кораллового полипа дискосома бурый цвет дают водоросли, а зеленый — флуоресцентный белок. И если посветить ультрафиолетовой лампой, которая, естественно, ему не нравится, он начинает сокращаться, с одной стороны, а с другой — видно, что это сине-зеленое покрытие довольно сильно экранирует, водоросли погружаются вглубь клеток и становятся защищенными флуоресцентными белками.
Поскольку функции почти не доказаны, это позволяет выдвинуть огромное количество гипотез. Понятно, что любая окраска, в том числе флуоресцентная, может служить разным функциям: это может быть привлечение жертвы или, наоборот, камуфляж, чтобы спрятаться; это может быть предупреждающая окраска, как есть у ос, пчел, когда специально яркие окраски позволяют предупредить об опасности; и, как я говорил, это может быть, например, распознавание своего вида в случае копепод, когда самец с самкой должны встретиться и найти друг друга в огромном океане.
Неожиданно пять лет назад была практически доказана одна из функций: было доказано, что привлечение жертвы действительно можно экспериментально показать. Хэддок и Данн (Steven H. D. Haddock, Casey W. Dunn) работали на такой медузе, она называется по-английски upside-down jellyfish, а по-русски — кассиопея. Она плавает кверху ногами, такая удивительная медуза, на мелководье плавает вниз куполом. И на щупальцах она содержит окрашенное малиновое пятнышко — это хромобелок, который не флуоресцирует, и флуоресцентный белок типа GFP, который дает зеленую флуоресцентную окраску. Если синим ее подсветить, эти пятнышки хорошо видны.
В чем сложность с такими организмами? Нет никаких экспериментальных подходов: мы не можем выключить ген, мы не можем подсадить туда ген так, как мы, биологи, привыкли делать с мушкой-дрозофилой или даже с мышью. Это всё экзотические объекты. Медузы — их очень трудно где-то содержать вне естественной среды. Но немножко можно.
И был применен такой элегантный подход, очень простой: они поместили медузу в одну часть аквариума, а рыбу — в другую, и перекрыли просто прозрачным экраном, стеклом. И сначала был барьер, который не позволял рыбе видеть, что происходит здесь, а потом его убирали, и рыба видела. И суть заключается в том, что рыба пытается атаковать медузу, хотя на самом деле в результате медуза ловит рыбу и съедает. Но рыба заранее это не знает, поэтому пытается атаковать чего-то. Стекло тут — для того, чтобы рыбу не съедали, а просто можно было посчитать, сколько раз она ударилась об это стекло. И оказалось, что в условиях, когда эти зеленые пятнышки очень хорошо видны, рыба атакует приблизительно в десять раз чаще, чем когда эти пятнышки не видны. То есть реально в природе (я думаю, что и в природе так) при определенном освещении эти зеленые пятнышки привлекают рыб и позволяют медузе их более эффективно ловить.
Более того, эти ученые, после того как нашли это явление, нырнули под воду с зеленой лазерной указкой и выяснили, что вообще рыбы обожают бегать за зелеными пятнышками, они совершенно как кошки играли с этой лазерной указкой. Вот такое прекрасное можно устраивать себе времяпрепровождение.
Но настоящий интерес к флуоресцентным белкам, конечно, рождается не от того, что это красиво и любопытно, как там оно в природе, в кораллах или в каких-то низших позвоночных и беспозвоночных экспрессируется, — это как раз плохо изучено. Настоящую популярность флуоресцентным белкам принесло, конечно, применение в биологии. И дальше я расскажу, как их применять как флуоресцентную метку.
Если мы посмотрим на наши клетки, то увидим фибробласты. Там явно происходит что-то очень интересное: они ползают, общаются, делятся, умирают, но если просто в микроскоп на них смотреть, практически ничего не видно, никаких деталей. И для того, чтобы эти биохимические и молекулярно-биологические детали рассмотреть, нам нужно покрасить или каким-то образом выделить необходимые нам молекулы.
И здесь я опять сделаю маленькое отступление про то, как всё устроено. Это так называемая догма, центральная догма молекулярной биологии. Она заключается в том, что ДНК служит хранителем генетической информации. И она реплицируется, это наш геном в хромосомах. Для того чтобы считать эту информацию, происходит так называемая транскрипция, в которой происходит синтез РНК. Это достаточно короткие молекулы, по сравнению с геномом — очень короткие, но они несут, в частности, информацию о белках, которые дальше на них синтезируются с помощью рибосом.
Синтез белка — это трансляция. Согласно этим нуклеотидам, которые здесь палочками обозначены, такими столбиками, белок синтезируется из уникальной последовательности аминокислот, которые и определяют его структуру и функционирование в виде ферментов, структурных белков, рецепторов, каналов, и т. д., и т. п. Поскольку GFP — это белок, и не требует ничего больше, то мы его можем в эту схему легко встроить и изучать внутреннее устройство клетки. Каким образом? Мы должны взять ДНК, кодирующую флуоресцентный белок — ну, например, в составе плазмиды или в составе вируса, каким-то образом. Доставить в ядро живой клетки эту ДНК — это может быть встроено в геном, это может существовать как такие отдельные эписомные плазмиды. Но главное, что после этого с них начинает считываться РНК, кодирующая флуоресцентный белок, и поскольку он кодируется единственным небольшим геном, то этой РНК достаточно, чтобы белок стал флуоресцентным и раскрасил нам клетку в том месте, где мы хотим. В данном случае это белочек, который идет в клеточные контакты. Он держится за стекло такими специальными клеточными контактами, которые как пальчики, как пяточки такие выглядят. И там находится некий белок, он называется зиксин. К нему мы подсоединили красный флуоресцентный белок, и теперь мы знаем, где зиксин сидит в клетке.
Более того, эта клетка живая, и поэтому мы можем увидеть всё в динамике. Мы, например, видим: вот клетка делится, а вот зиксин частью остался на стекле, а потом клетка сделала опять новые клеточные контакты. Или без деления мы видим эту динамику — как клеточка ползет и образует, например, вот здесь, новые клеточные контакты. Мы видим, как она продвигается дальше и закрепляется на стекле.
Всё это дает динамическую картину того, что происходит в клетке с какими-то целевыми белками и многими другими молекулами. Собственно, за это и была присуждена Нобелевская премия, потому что GFP привнес в клеточную биологию вот такую динамику, когда мы в реальном времени видим, что происходит в живой клетке. Нам не надо ее фиксировать, красить антителами или красителями, всё видно и так.
Таким образом, как мы уже коротко сформулировали, GFP — это, собственно, первая генетически кодированная метка, и, в отличие от химических красителей, ее можно закодировать в геноме и получить трансгенные организмы или клетки. Вот мы взяли ген из медузы и помещаем в любой другой организм, и там мы получаем флуоресцентные клетки, флуоресцентные белки и видим разные структуры. Изобретение красных белков позволило расширить палитру, то есть мы теперь можем видеть сразу, одновременно несколько цветов — это всегда гораздо полезнее и информативнее, чем только какой-то один цвет. Немножко потом про это поговорим. Это вот белки кораллов дали большое разнообразие цветов, особенно в красной области.
На сегодняшний момент описано довольно много флуоресцентных белков в разной части спектра, от дальне-красной до синей. Яркие (вот тут яркость по оси Y) только в зеленой области — это досадно, потому что наши ткани прозрачны для красного света, и было бы очень хорошо для экспериментов на животных иметь дальне-красный белок.
Как можно использовать GFP? Поскольку это белок, вы можете подставить это под целевой генный промотор. И в том месте и в то время, где работают целевые генные промоторы, вы увидите флуоресценцию. Можно приготовить белок слияния с целевым белком, и тогда вы увидите, где в клетке расположены эти флуоресцентные белки. И наконец, мы можем произвести молекулярные сенсоры, которые чувствуют различные очень важные события: колебания концентрации ионов или pH, появление вторичных мессенджеров, активацию сигнальных белков, и т. д., и т. п.
Есть разные типы сенсоров. Важно, чтобы это событие привело к изменению флуоресценции, и тогда мы смогли бы его увидеть.
Дальше несколько примеров того, как это выглядит. Вот мечение целых организмов. Вы можете пойти практически в любой зоомагазин и купить рыбок, обычно они раскрашенные сильно. Это флуоресцентные белки тех рыбок, которые исходно были не раскрашенные. Можно сделать трансгенную мышку или даже поросенка, который будет вот такой зеленый или красный. Но более важно, конечно, метить клетки в реальных системах, это позволяет очень четко визуализировать какие-то субпопуляции клеток. Например, это сенсорные нейроны и интернейроны в дрозофиле, или вот на срезах мозга мыши можно увидеть специфические клетки, которые помечены на GFP через специфические промоторы.
Это также удобная система для слежения за раковыми опухолями в модельных животных. Вы можете видеть рост, прогрессию опухоли по флуоресценции. Это, естественно, модельная система. И, соответственно, этот прогресс легко наблюдать, и наблюдать эффект лекарственных средств, которые вы изучаете, скринируете. Насколько хорошо лекарство действует. Это позволяет не вскрывать мышь, не убивать ее, а следить за ней какое-то время прижизненно, за ростом этой опухоли.
Очень приятные, красивые сенсоры на клеточный цикл были сделаны. Здесь клетки делятся, но хорошо это видно, только когда они в стадии деления — митоза. Все остальные стадии очень похожи друг на друга морфологически. Японцы сделали такой индикатор, в котором на одной стадии клеточного цикла клетки красные, а на другой они зеленые. И если на это посмотреть, то видно, как это меняется по ходу деления — очень красивые переходы и, главное, очень хорошо различимые. Этим сенсором активно сейчас пользуются, можно легко разделить разные фазы клеточного цикла.
Очень мне нравится направление, мы в нем тоже сейчас работаем, очень многоцветного мечения. У флуоресцентных белков всего несколько цветов. Но точно так же в мониторе, в компьютере, в телевизоре, в проекторе мы видим очень много цветов за счет сочетания, то есть вот этот RGB-цветовой матрикс построен ведь просто из трех цветов, и видим мы на самом деле тремя типами колбочек. Но различное сочетание красного, зеленого и синего дает много оттенков.
И вот есть технологии, которые позволяют загрузить в клетку разные количества флуоресцентных белков, и это происходит стохастически, случайно. Каждая клетка получает некий набор генов, кто-то больше красного, кто-то больше синего… И когда мы это всё смотрим, оказывается, что они разные, то есть каждая такая группка — это потомок одной клетки. Но она хорошо отличается от потомков соседней клетки. И это очень мощный инструмент, когда вы изучаете развитие животных или опухолеобразование. Вы можете видеть, из какой популяции клеток что образовалось, следить за этим.
Примеры мечения белков. То есть когда мы хотим увидеть, где расположен белок в клетке — филаменты, мембраны, ядра и т. д. Очень много белков можно пометить флуоресцентным белком. Это не очень скажется на его функциях, и можно наблюдать его в живой клетке. И, как я уже показывал, это можно делать в динамике и таким образом видеть то, что ранее было скрыто от глаз исследователей, — например, в реальном времени рост микротрубочек. Или динамику микротрубочек в ходе клеточной миграции. Всё это делается так, что просто в микроскоп снимается кадр за кадром раз в несколько минут или раз в несколько секунд, и дальше из этого составляется картинка, такое кино жизни внутри клетки.
Следующий пример — это мечение хромосом с помощью гистонов. Вы можете в прямом режиме видеть, в реальном времени, как клетка делится, разделяет свои хромосомы на две дочерние клетки, — это тоже очень полезная и массированная информация.
За счет того, что у белков разные цвета, вы можете в одной и той же клетке видеть разные структуры. Это просто последовательно разные флуоресцентные каналы, вы можете метить разные структуры. И это важно, потому что каждая клетка имеет свою форму, и вы не можете соотнести белки из разных клеток друг с другом, только внутри одной клетки.
Сенсоры. Здесь немножко сложный, может быть, для объяснения эксперимент, но очень красивый. Если приглядеться, здесь мышка сидит на большом шаре. И она зафиксирована, голова у нее зафиксирована, а в голове проделано отверстие, заделанное стеклышком. Мышка чувствует себя на самом деле нормально. И в это стеклышко можно заглянуть и посмотреть, что происходит в нейронах, в поверхностных слоях. А мышка, поскольку она сидит на шаре, который крутится, думает, что она куда-то ползет. И мы с помощью микроскопа видим, что происходит в нейронах живой и двигающейся мыши в тот момент, когда она куда-то бежит. И дальше видео, как это происходит: вот здесь мышка на шаре бегает, перед ней компьютерный экран, проектор, куда проецируется, согласно ее движениям, изображение лабиринта, точно как в компьютерных играх нам показывают какой-то лабиринт и мы по нему бежим, двигая мышку. Вот она точно так же двигает мышку, только всем своим телом. И ей кажется, что она куда-то бежит: вот она видит эти стены, потолок, какие-то коридоры… И одновременно снимается активность нейронов. И можно проследить, какие нейроны отвечают за восприятие каких паттернов (вот полосочки эти, зрительная, видимо, кора, которая возбуждается). Эти сенсоры позволяют делать очень сложный эксперимент о живом организме.
Ну и, наконец, некоторые перспективы. С одной стороны, область очень разработанная, стаж исследований уже приближается к 30 годам. Тем не менее остается довольно много вопросов.
Если говорить про фундаментальные исследования, то, как я говорил, довольно слабо изучена часть нативная, то есть каково природное разнообразие, в каких группах есть флуоресцентные белки, в каких нет, что они делают там, как они возникли в ранней эволюции, как они терялись или приобретались в ходе эволюции — тут масса вопросов. Они сложные и, конечно, тут прогресса ждать придется долго.
С другой стороны, очень интересно понять, как биохимически и биофизически работает эта штука, прямо на уровне молекулы, то есть суметь просчитать компьютерно, суметь всё это прощупать. Какие аминокислоты конкретно ответственны за какой цвет. С одной стороны, понимать это всё интересно. С другой, это может позволить управлять спектральными свойствами флуоресцентных белков и производить те варианты, которые нам нужны. Например, цвет или какие-то еще свойства. Направленный дизайн делать.
Это переводит нас в плоскость практического использования. И здесь довольно много флуоресцентных белков, хороших и ярких, уже сделано. Я бы сказал, что сейчас наиболее актуальным является получение фотостабильных вариантов. В целом, во флуоресцентной микроскопии используются высокие потоки, высокие интенсивности света, и часто мы видим картинку, а потом через несколько кадров она исчезает, потому что флуоресцентный белок просто выгорел. Он физически, химически окислился и сгорел. А хочется видеть долго, и есть варианты, которые, может, не столь ярки, но они позволяют долго-долго смотреть за одной и той же системой. Это важно для многих работ.
Также важно получение дальне-красных вариантов, чтобы работать с животными. Все-таки большинство биомедицинских исследований ведется на животных: на мышах, на крысах. И всё, что происходит в глубине тела, очень трудно увидеть во флуоресцентном режиме. Свет рассеивается, поглощается, и варианты — вот здесь, в данном случае, самое яркое пятно — это дальне-красный белок, который хорошо проходит через наши ткани.
Прекрасная тема — это сверхразрешающая флуоресцентная микроскопия. За нее дали в 2014 году Нобелевскую премию, но тем не менее там еще очень много работы. По сути, это выход на совершенно другой уровень в микроскопии, где дифракция света, которая мешает получать подробные изображения, больше не мешает, не очень мешает, и мы вместо размытых пятен получаем очень детальные изображения в нанометровой шкале, и это фактически новая эра флуоресцентной микроскопии. Это всё равно что человеку, у которого безобразное зрение и который видит вот такие размытые пятна вместо окружающего мира, дать очки и наконец позволить увидеть это прекрасное четкое изображение, которое мы теперь способны детектировать.
Мультицветное мечение — очень, мне кажется, классная тема, когда мы развиваем разные комбинации. Сейчас доступно примерно 100 комбинаций цветов, и мы работаем над тем, чтобы достичь миллиона комбинаций и пометить некоторые системы с точностью до единичных клеток.
Ну и, наконец, довольно сложная, может быть, для рассказа тема, но, если в общем и общими словами, это некие универсальные сенсоры на всё. Дело в том, что состояние клетки очень во многом зависит от эпигенетических маркеров хроматина, то есть хроматин во всех клетках одинаковый, то есть ДНК, но разные участки несут разные эпигенетические маркеры. Это метилирование, ацетилирование и т. д. Как ДНК, так и гистонов, на которых ДНК накручена, уложена. И от того, какие это эпигенетические маркеры, и зависит судьба клетки. То, что мышечные клетки отличаются от нейронов или от кожи и т. д., — это всё эпигенетическая составляющая. И если мы научимся разделять, визуализировать это состояние, то получим очень мощный инструмент анализа физиологического состояния любой клетки с помощью флуоресцентной микроскопии. Этим мы сейчас очень плотно занимаемся. Там используется микроскопия плюс довольно обширное машинное зрение, искусственный интеллект и т. д., которые позволяют на основании, казалось бы, бессмысленных пятнышек дифференцировать клетки по их состоянию на разные группы.
Долгин: Спасибо большое, Константин. Ну, собственно, главные поводы для вопросов, которые возникли у меня, были как раз в самом конце. Это действительно вопрос о том, каким же образом мы сможем (и сможем ли когда-нибудь) понять, как возникли и распространились эти белки. Или продолжится некоторое определенное состояние, неопределенное понимание: то ли это горизонтальный перенос, то ли это что-то другое… Есть ли у нас инструменты, есть ли понимание, как вообще мы сможем это понять?
Лукьянов: С одной стороны, конечно, все эти эволюционные вопросы с какой-то точки зрения вообще никогда нельзя решить, потому что мы же не можем обратно открутить и понять, что произошло на самом деле. Мы можем только более или менее достоверно догадываться о том, что происходит, на основании сиквенсов и других данных. Мне видится следующее: во-первых, надеюсь, наберется больше статистики по видам, которые несут эти флуоресцентные белки. Ну, или наоборот — будет понятно, что вот там точно нет. Потому что все-таки охват сейчас далеко не полный, мягко говоря, и, конечно, многие не очень широко ходовые вещи не изучены. Это может дать ключ.
Сейчас… по сиквенсам если строить деревья, в принципе нету следов. Я бы сказал, что горизонтальный перенос здесь маловероятен. Потому что они группируются так, как они и должны группироваться согласно этому дереву. Просто они настолько разбросаны, что это просто функционально приходит в голову, тем более что действительно рачки, бывает, поедаются медузами, или наоборот. То есть что-то можно предложить.
Пока я бы сказал, что нет, это менее вероятно, чем просто обычное развитие. Там, скорее, в функции это упирается. На сегодняшний момент я бы сказал, что они такие, ну, не очень важные, что этот ген в ряде случаев, видимо, полезен, но иногда мы даже не можем сказать, зачем. Но его, видимо, легко можно потерять, и эти все серые группки (человек, моллюски, черви), мне кажется, потеряли. Ну, не нужно им было. И это не тот ген, без которого нельзя жить. Он просто легко терялся.
Другой вопрос, гораздо более интересный: как он возник. Потому что если он возник так рано — тогда ни у кого не было ни глаз, ни этих там эндосимбионтов, — это должна быть какая-то первичная функция, такая как бы базовая. Например, возможно, защита от солнца. Некий пигмент, который позволяет экранировать себя от какого-то излучения.
В принципе, мы немножко любим про это спекулировать на очень высоких порядках спекуляции, я бы так сказал. Мы в какой-то момент обнаружили, что GFP довольно легко участвует в переносе электронов, то есть он работает как такой электрон-донор, иногда электрон-акцептор. Именно светозависимый. Вы можете посветить на GFP, и, если ему дать подходящую молекулу, он легко скинет на нее электрон, станет красным. И это начинает быть похоже на какую-то функциональную систему — ну, может быть, не фотосинтез прямо, не такой высокоорганизованный, но это, по крайней мере, что-то, что позволяет либо почувствовать свет, либо произвести эти высокоэнергетические электроны, которые могут быть дальше использованы для восстановления чего-то важного.
Но очень трудно догадываться. Это тянет на первичную функцию какую-то, но доказательств никаких, конечно, нет, и даже не очень понятно, как к этому двигаться.
Долгин: А не могло быть независимого возникновения этого в разные моменты у разных…
Лукьянов: Нет-нет. Это четко одно семейство. В отличие от люцифераз, с которых я начинал (там действительно 40 и более раз они возникали независимо из разных совершенно ферментов, которые занимаются разными вещами), здесь они четко гомологичны. «BLAST» и всякие другие программы совершенно без сомнения их друг на друга налепляют. Там минимум, наверное, 20 %, может быть, 17 % идентичности. Этого более чем достаточно, чтобы понять, что это действительно один раз возникло, и это монофилетическое семейство.
Долгин: Да, спасибо. И, конечно, очень интересно прозвучал самый последний ваш слайд, о возможности использования…
Лукьянов: Эпигенетика.
Долгин: Да-да-да. Универсальные сенсоры...
Лукьянов: Мы сейчас в очень глубоком процессе этого изучения. Вообще, imaging становится очень компьютеризованной, честно говоря, прямо без информатики такой специальной здесь сейчас трудно продвигаться. С другой стороны, это не очень разработано. То есть надо использовать отчасти глубокие современные методы машинного обучения, зрения, чего-то такого, в которых я совершенно ничего не понимаю, это у меня какие-то отдельные информатики работают с этим, и, надо сказать, довольно ощупью. Это непростая, не очень понятная тема.
И да, это выглядит перспективно с точки зрения очень разных направлений. Так можно изучать и старение клеток, и… вот здесь — такой маленький драг-скрининг, когда вы клетки поливаете разными веществами и видите, что они по-разному воздействуют. Это какое-то условное состояние, это никак нельзя интерпретировать толком, это просто условные координаты в многомерном пространстве. Но главное, что это позволяет классифицировать состояния клеток и узнавать сходные между собой состояния и, наоборот, разделять различные. И мне видится, что там и в биологии развития очень большие возможности применения, когда мы прямо в ходе развития видим, что вот эта клетка пошла по другому пути (хотя это внешне очень трудно понять); и в опухолеобразовании тоже есть своя гетерогенность, которую, я надеюсь, мы будем когда-нибудь видеть.
Долгин: Ну да, это классический вопрос о том, откуда возникают онкозаболевания, одно ли это заболевание, или их множество из разных источников.
Лукьянов: Да. Ну, это абсолютно новая тема, и у меня нет ни одной статьи про это, мы сейчас первую пытаемся сделать. Как перспектива, мне кажется, это очень классно.
Долгин: Замечательно. Спасибо. У нас уже очень много вопросов. «Скажите, пожалуйста, могут ли данные белки использоваться в растениях (например, чтобы наблюдать за механизмом работы различных иммуноиндукторов)?»
Лукьянов: Да, в растениях их применяют. Там уже не нужны дальне-красные белки, эти всякие слова про дальне-красные — это к животным относится. В растениях, наоборот, полная смерть из-за того, что хлорофилл флуоресцирует в дальне-красной области. И они вполне счастливы с зелеными белками. Да, очень активно в растительных. Там у меня были картинки растений, если полистать презентацию, там есть даже какой-то такой росток. Арабидопсис. Всё это абсолютно применимо к растительным клеткам.
Долгин: «Какое, с вашей точки зрения, самое важное открытие было сделано с использованием флуоресцентных белков?» Я думаю, что это достаточно трудный вопрос.
Лукьянов: Их очень много. По статистике, если вы PubMed пробьете на «green fluorescent protein», то просто каждый год выходит около 5 тыс. статей на тему использования. Некоторые из них — про GFP, но таких мало относительно. И это тенденция уже многолетняя, то есть за все эти годы было опубликовано, наверное, под 100 тыс. разных статей с флуоресцентными белками.
Может быть, это субъективно, я как-то под этим углом зрения никогда не рассматривал, но мне кажется, что очень важное, переломное такое изменение парадигмы было про динамику. Собственно, GFP — это про внутриклеточную динамику. Потому что вы можете увидеть целевой белок с помощью антител. Вы можете взять клетку, зафиксировать ее и с помощью специфических антител к конкретному белку (антитела покрасить любым флуорофором, типа ФИТЦ или каким-то другим) увидеть те паттерны, которые я показывал. Но вы не будете видеть это в динамике, как здесь. Это будет просто image, по которому очень трудно сказать, что там происходит, с какой скоростью. И GFP внес эту живость. Это всё равно что сравнивать фотографию и фильмы. Можно, конечно, по фотографиям как-то реконструировать, но трудно очень и всё равно недостоверно.
И после этого стала понятна динамика в очень многих случаях. Самый, может быть, простой и яркий пример — это ядрышки. Я уже не помню, в каком году их кто первый описал, но лет 150 их в микроскоп видят. И это такая немембранная органелла, которая видна, и вы можете за ней следить, и на первый взгляд это довольно стабильное образование. Вы можете следить за клеткой часами: там будут ядрышки, несколько штук, они стоят на своем месте, ну, иногда чуть-чуть двигаются, но с ними ничего не происходит, пока клетка не начала делиться (тогда, естественно, они перестраиваются). И только с открытием GFP, вот представьте себе, в 2000 году, — сейчас это выглядит как 20 лет назад, но на самом деле, с точки зрения развитой биологии, это не так уж давно, — журнал «Nature» печатал статьи, где были очень простые эксперименты. Вот я сейчас могу таких экспериментов за день три штуки поставить, и это может сделать любой студент. Но тогда это было в новинку, эксперимент демонстрировал, что ядрышковые белки (они были известны, там, много разных — фибрилларин и т. д.) — они все очень мобильные, что вот через эту структуру ядрышка непрерывно прокачиваются белки. Это только внешняя стабильность, а белки там обновляются в минутной шкале: буквально две-три минуты — и белок втек и вытек оттуда. Это позволяют видеть специальные технологии с помощью GFP.
И это осознание чрезвычайно большой мобильности очень многих структур, которые считались до того стабильными, существующими долгое время. Этот взгляд на динамику, мне кажется, по крайне мере, очень важен. Не знаю, самый ли он важный, но очень важный.
Долгин: Разные наши слушатели благодарят вас за лекцию и в том числе спрашивают (не знаю, имея ли в виду, что это прямо сейчас прозвучит, или это некоторая просьба к вам или к нам когда-нибудь еще устроить лекцию) о флуоресцентных грибах хоть немного.
Лукьянов: Там люминесцентные грибы. Это надо Ямпольского позвать. Это замечательная тема.
Долгин: Я знаю, что это замечательный ученый, да, конечно, с удовольствием.
Лукьянов: ...про люминесценцию в целом, они открыли кучу новых люминесцентных систем, это абсолютно мировой прорыв, в частности, грибы. Загадочная тема: зачем люминесцируют организмы, например, грибы, кто-нибудь может сказать? Такой забавный вопрос. А они довольно ярко светятся, их видно. Это большая тема, я бы за нее не взялся, потому что есть специалисты у нас. Думаю, что, если их привлечь, они дадут прекрасные данные.
Долгин: Спасибо за совет. Просят еще подробнее рассказать, какие работы вы провели в Институте с помощью флуоресцентных белков.
Лукьянов: Мы разработчики, то есть мы делаем методы, мы их практически не применяем. Мы их применяем до того момента, чтобы просто показать и опубликовать это, чтобы было видно, что это работает. Это модельные эксперименты. В основном, наукой как таковой, как извлечение фундаментальных знаний с помощью флуоресцентных белков, мы не занимаемся. Мы либо изучаем сами флуоресцентные белки, их свойства (онтогенез, биофизика какая-то, новые ищем), либо делаем методы с прицелом на каких-то реальных биологов, которые затем это берут и используют. Так что таких работ, ну, пожалуй, просто и нет, серьезных по крайней мере.
Долгин: Спасибо. Есть комплекс вопросов, связанных с человеком. «Проводились ли эксперименты при использовании подобных белков в организме человека? Есть ли уже люди со светящимися органами?»
Лукьянов: Это хороший вопрос. Нет, потому что вам нужно внести генетическую информацию. В человеке это запрещено. Вот когда разрешат делать трансгенных детишек, зеленых, то, может быть, можно будет такое сделать. Но я думаю, что это никогда не разрешат, да и не нужно, по сути. Поэтому к медицине как таковой, к человеку напрямую это неприменимо, потому что нельзя вносить флуоресцентные белки. Одно дело, если вы рискуете ради того, чтобы какой-то важный ген поправить или внести какой-то важный фермент, который вам позволит жить и не умереть от какого-нибудь страшного заболевания, а другое дело... ну, зачем GFP в себя вносить? Это лишнее.
Можно работать с клетками человека, это пожалуйста. Культуры клеток человека, или вот эти индуцируемые плюрипотентные клетки (iPSC) — там можно вставлять GFP и что-то изучить в клетках пациента. Но их нельзя уже обратно подсаживать. GFP, естественно, страшно иммуногенен: в нас нет никаких флуоресцентных белков, поэтому любые клетки с флуоресцентными белками будут отторгаться очень эффективно.
Так что нет, это в целом неприменимо, к сожалению. Нельзя никогда сказать «Я сейчас это сделаю, а потом в медицине применю», как биологи любят, чтобы гранты дали и чтобы любили нас. Здесь продолжение практически нереально.
Долгин: «Насколько технически сложно/долго/дорого таким образом окрашивать разные микроорганизмы? Как долго держится результат? Ровно столько, сколько живет организм?»
Лукьянов: Если вы внесли в геном, то да. Если вы получили какую-то стабильную линию, будь то бактерия… Бактерии можно в геном это посадить. Это не очень просто, но и не очень сложно. Тогда это будет навсегда. Если это на плазмиде, то пока вы будете держать антибиотик, как это принято... Плазмида содержится, вот чтобы она не выбрасывалась, в среде существует антибиотик, а в плазмиде — устойчивость к этому антибиотику. Тогда это будет тоже практически навсегда. Так же и с высшими клетками. Если вы получили трансгенную линию клеток, раковых, например, вы дальше можете ее использовать сколько угодно, она будет всегда такой. Так же и мыши или мушки. Когда вы стабильно загнали это в геном, это существует навсегда.
Это недорого. Ну, то есть один раз это требует каких-то усилий, но это сильно дешевле, чем окраска антителами или химическими красителями. И, например, для широкомасштабных скринингов, когда идет сотнями тысяч скрининг веществ на клетках — чем фармкомпании, например, занимаются, там основная стоимость, если говорить про окраски всякие, — это антитела. Это примерно 80 % стоимости всей процедуры. И если вы делаете это на GFP, вы в пять раз оптимизируете примерно. Так что в целом это дешевле, хотя предварительные этапы несколько дольше и сложнее.
Долгин: «Можно ли использовать флуоресцентные белки, чтобы следить за тем, как коронавирус (ну, видимо, и другие вирусы. — Прим. Б. Долгина) поражает те или иные органы?»
Лукьянов: Опять же, тут то же самое: на моделях — можно. На человеке — по тем же причинам, о которых я говорил перед этим, нельзя. Можно сделать флуоресцентные белки коронавируса или весь коронавирус такой — естественно, это должны всякие специальные организации этим заниматься, чтобы не заразиться самим, как высоко патогенным вирусом. На самом деле, мы ровно сейчас этим занимаемся. Мы в неопасных системах, просто отдельные белки коронавируса Sars-Cov-2 метим флуоресцентными белками и пытаемся проследить их поведение в клетках человека. Есть такая задача.
Ну, в принципе, да. Как изучение — да. Как диагностика или тем более лечение — нет, не вижу тут возможностей.
То есть в целом GFP — это классный инструмент для изучения и абсолютно бессмысленный инструмент для медицины и диагностики вот этого всего.
Долгин: А это может измениться?
Лукьянов: Наверное нет, потому что...
Долгин: Или это всё, к тому же, сводится о разрешении на использование для человека...
Лукьянов: Ну, это внесение генов. Но даже дело, наверное, не в разрешении как таковом, а в том, что это травматично, и неэтично, и не нужно. Там все-таки антитела есть, амплификация есть, ПЦР, куча всяких диагностических… Зато для моделей, где вы не связаны такими морально-этическими проблемами… Может, это как раз изменится. Я, скорее, поверю, что это изменится в эту сторону — скорее на животных запретят, чем на человеке разрешат. Но пока можно, и пока это осмысленно, очень удобно, глубоко можно изучать живые организмы, самые разные: и растения, и грибы, и бактерии, и животных.
Долгин: «Как именно GFP переизлучает свет?»
Лукьянов: Про это я не стал, конечно, рассказывать. Наверное, у меня где-то в конце был слайд, давайте я прокручу. Вот единственный слайд, который у меня есть про это.
GFP на уровне белка — это такой вот, здесь схематично его структура показана, так называемый бета-бочонок, то есть реально это прямо из белковой цепи сформированная такая бочечка плотненькая, внутри проходит спиралька, и на этой спиральке — вот тут зеленым нарисовано в центре — это флуорофор, хромофор, вот он тут же показан на молекулярной картинке. Он формируется путем модификации собственных аминокислот. Если кто-то в курсе, вот это тирозин бывший, и вот это — новое кольцо, такого не бывает в других белках, которое формируется за счет влияния окружения. Этот бочонок выступает как катализатор, как химический стаканчик, в котором в центре происходят всякие интересные события, химические реакции, которые зависят от окружения, от групп, которые торчат в центр. И он умеет формировать вот такую группу. А она представляет из себя маленький пигмент. То есть тут двойные связи, правильно расположенные через одну, так называемая р-конъюгированная система образуется, когда двойная связь чередуется с одинарной, и все вместе позволяет обобществлять этот р-электрон. И такие системы — так пигменты устроены любые: и каротиноиды, и порфирины, и гемы, и так далее — позволяют поглотить квант света. Этот электрон поднимается на более высокий уровень и потом скатывается обратно и при этом высвечивает фотон. Ну, в данном случае зеленый, а в красных белках эта система чуть больше, вот за счет этого места она еще больше, и там красный фотон получается.
Но это большая задачка, вокруг этого часть народу сидит и изучает и биохимию, и биофизику. Там много фотореакций, бесконечные количества, практически неисчерпаемые, как электроны.
Долгин: «Флуоресценция и биолюминесценция предположительно могут нести одинаковые функции, или это все-таки разные истории?»
Лукьянов: Где-то они пересекаются. И там, и там свет производится так или иначе, или окраска. Да, они где-то пересекаются.
Но все-таки биолюминесценция отличается тем, что это происходит, в основном, в полной темноте и характерно для организмов, которые… Если так массово брать, 99 % этих организмов живут глубоко в океане, там, где вообще света нет. Или частично, какое-то время нет света. И они таким образом как-то находят друг друга или, наоборот, пугают друг друга, они привлекают жертву, как все знают с этим удильщиком, который этим поплавочком дергает, а потом рыбку ловит. Вот в этом темном царстве, где в ряде случаев вообще никогда света нет, люминесценция как-то позволяет какие-то проблемы решать.
Флуоресценция всегда связана со светом, поэтому это такие условия, скажем так, странные: это нам хорошо — облучил конкретным диодом, указкой или фонариком или флуоресцентным микроскопом, — но в природе-то это просто белый свет, в основном, и он, с одной стороны, скрадывает эту флуоресценцию. С другой стороны, все-таки ее видно, ну, мы же видим, есть много таких предметов, когда вы прямо четко видите, как флуоресценция проявляется, она все-таки заметна.
И как окраска — тоже, вот как я кораллы показывал. Совершенно не обязательно их подсвечивать, и так они более-менее окрашены.
Есть масса гипотез про то, что функция GFP вообще не связана с окраской и флуоресценцией никак. Например, это защита от активных форм кислорода или еще какая-то такая... Что эта структура позволяет делать еще что-то, а то, что она флуоресцирует, — это некий побочный эффект.
Долгин: Дополнительная функция.
Лукьянов: Да. Ну, где-то она была подхвачена отбором, например, когда-то что-то цветное возникло — вы можете камуфляж или привлечение сделать. Но в целом исходная функция вообще никак со светом не связана.
Но мне это кажется неправильным. Наверное, все-таки мне ближе идея, что там свет как-то участвовал. Но это дело такое, можно предполагать разное.
Долгин: «Меняется ли поведение организма при введении флуоресцентных белков?»
Лукьянов: Хороший очень вопрос. Да, естественно, внося любые такие искусственные вещи дополнительные, вы можете ожидать неприятностей, и в частности изменений. Ну, как поведения... то есть я не буду говорить, что поведение на уровне behavior, поведение животного. Но если вы присоединяете это к какому-то белку, то совершенно точно могут быть очень печальные последствия, вплоть до полной потери функций этим белком.
К счастью, оказалось, что обычно можно подобрать условия. Сейчас покажу этот слайд — вот этот химерный белок может вести себя плохо. Вообще, довольно ожидаемо, потому что GFP — довольно большой белок, бывает так, что таргет меньше, чем сам флуоресцентный белок. Но к счастью, видимо, в целом белки устроены модульно. Они сделаны так, что каждый домен может функционировать отдельно. Это как некое правило, там часто идет обмен доменами, или слияние каких-то белков, то есть в целом это не совсем искусственная ситуация, — оказалось, что в очень многих случаях это абсолютно допустимо, скажем так. Когда вы делаете первый раз какой-то химерный белок, вы обязательно должны поставить кучу контролей на то, что он ведет себя правильно. Что он локализуется правильно — так же, как нативный белок (это проверяется антителами), что он делает свою функцию примерно так же… Но оказалось, что примерно в 90 % случаев вы можете подобрать — подсоединить GFP слева от белка, то есть с начала белка, а можете подсоединить с конца. И кто-то из целевых белков чувствителен к началу, а кто-то — к концу. Вам заранее обычно трудно это представить. Вы даже можете встроить это в середину, хотя это более травматично. Вы можете удлинить вот этот линкер, вот это соединение, оно может быть разной длины: очень короткое, очень длинное. И это каждый раз экспериментальная работа: подобрать такие условия, чтобы белок чувствовал себя более-менее адекватно.
Конечно, есть много критики, есть люди, которые говорят: «Нет, никогда, GFP не позволяет, это всё искусственно». Но это дает настолько большие преимущества, что если вы понимаете, что ну окей, поведение может быть изменилось, но совсем чуть-чуть, — то (имея в голове, что да, возможны артефакты) это можно использовать и получать массу интересной информации.
Долгин: И можно, видимо, как-то подробнее начать понимать, каковы масштабы искажения, каковы конкретные виды искажения?
Лукьянов: Ну, это да. Нет, иногда всё очень просто. Место, например, слева — это актин, это бета-актин, цитоскелет клетки. Он формирует такие длинные тяжи, красивые очень. А если вы плохой флуоресцентный белок присоедините (такие тоже есть, например, он не одиночный, а формирует тетрамер — целых четыре штуки, таких большинство природных, их приходится долго мучать, чтобы они стали нормальными) — вы вместо этих волокон увидите просто огромные блямбы, лежащие по всей клетке агрегаты. Потому что тетрамер всё на себя налепил: этот полимер, этот тетрамер — всё вместе свалилось в кучу абсолютно бессмысленно. И это даже проверять не надо долго, видно, что он нефункциональный.
А есть, конечно, более тонкие случаи, когда чуть-чуть подвижность другая стала… ну как, подвижность вообще очень трудно померить без GFP, поэтому это всегда большой вопрос. Но в целом эта технология поэтому так и популярна, и Нобелевские премии, и статей выходит очень много, — потому что это работает. Что в принципе допустимо.
