Нобелевскую премию этого года по химии получат американские биохимики Эммануэль Шарпантье (Emmanuelle Charpentier) и Дженнифер Дудна (Jennifer Doudna) за развитие метода редактирования генома CRISPR/Cas. Это давно ожидавшееся решение, в течение последних пяти лет создатели этой технологии упоминались в числе наиболее вероятных кандидатов на Нобелевскую премию. Правда, чаще речь шла о премии в области физиологии и медицины, а не химии. Можно даже предположить, что Шарпантье и Дудна, узнав имена лауреатов в понедельник, подумали: «Ну, не в этом году», — и расслабились, а спустя два дня были удивлены новостями.
Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна
С тех пор, как ученые узнали роль генома в живых организмах, у них вновь и вновь появлялось желание изменить генетическую информацию. Ведь так можно получить животных или растения с желаемыми свойствами или же, исправив вредоносную мутацию, вылечить врожденную болезнь. Они научились вносить в геном новые гены при помощи специально сконструированных вирусов и некоторых других технологий, но точность этих методов была все-таки ниже желаемой. CRISPR/Cas и ряд других способов, появившихся в XXI веке, стали новым шагом в этом пути. Они позволяют разрезать цепочку ДНК в выбранном месте, чтобы отключить определенный ген, или же нарастить в вырезанном участке новую цепочку по выбранному шаблону. Из этих методов система CRISPR/Cas стала самой популярной из-за наиболее удачного сочетания эффективности и безопасности.
Надо признать, что человечество овладело таким эффективным методом редактирования генома благодаря прокариотам: бактериям и археям. Всё началось с того, что в 1987 году группа японских ученых обнаружила в геноме кишечной палочки (Escherichia coli) область, где имелось несколько повторяющихся коротких последовательностей нуклеотидов, которые, к тому же, были палиндромными. Отсюда позже возникло название CRISPR, что значит «Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats» — короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами. Палиндромы разделялись участками ДНК, которые получили название спейсеров. Если палиндромы совпадали между собой, то спейсеры были уникальными. Очень быстро аналогичные области генома были найдены и у других бактерий, в том числе у возбудителей туберкулеза, чумы, дифтерии и ангины. Обнаружились такие группы палиндромов и спейсеров и у других прокариотических организмов — архей. По данным на 2007 год, такие структуры были найдены в геномах 45 % бактерий и 85 % архей.
Группу палиндромов, разделенных спейсерами, называют CRISPR-кассетой. В самой короткой известной CRISPR-кассете всего два спейсера, в рекордно большой, которая обнаружена у бактерии Haliangium ochraceum, их 587. Обычно их от нескольких десятков до пары сотен. Не редкость, что в геноме содержится больше одной CRISPR-кассеты, например, у археи Methanocaldococcus jannaschii насчитывается 18 кассет. Спейсеры, как правило, равны по длине, но, как уже говорилось, различаются по составу нуклеотидов. Еще не зная, какую роль играют CRISPR-кассеты в жизни бактерий и архей, ученые придумали, как извлекать из них пользу. По наборам спейсеров оказалось легко различать между собой разные штаммы бактерий, в том числе важных для медицины. Заметили исследователи еще одну вещь. У прокариот, имеющих CRISPR-кассеты, недалеко от них в геноме обнаруживались гены, которых не было у организмов, лишенных таких кассет. Их стали называть cas-генами, то есть «CRISPR-associated» ассоциированными с CRISPR. Cas-гены кодируют cas-белки.
Было выдвинуто немало гипотез о функциях CRISPR, но понимания удалось достичь только в 2005 году, когда сразу три группы ученых, исследовавших разных бактерий, пришли к сходным результатам (1, 2, 3). Они сравнивали нуклеотидные последовательности в спейсерах с другими известными науке геномными последовательностями и обнаружили, что спейсеры совпадают с фрагментами геномов бактериофагов — вирусов, специализирующихся на заражении бактерий. Получалось, что, если бактерия будет заражена фагом, но сумеет выжить, она записывает данные об этом фаге — фрагмент его генома — на свою CRISPR-кассету. Эти записи можно сравнить с фотографиями на стенде «Разыскиваются преступники». Если такой же бактериофаг проникнет в бактерию вновь, они помогут его найти и уничтожить.
На каждом спейсере синтезируется молекула РНК, которая соединяется с одним или несколькими белками из семейства Cas. Комплекс из нескольких белков получил название белковый комплекс Cascade (CRISPR-associated complex for antiviral defense), в тех же случаях, когда белок один, это белок Cas9. Для простоты мы будем говорить только о нем. В паре РНК и Сas9 молекула РНК отвечает за «найти», а белок — за «уничтожить». Поскольку РНК комплементарна части генома вируса, то, встретившись с ним, она его опознает и присоединится к вирусной ДНК. Таким образом она доставляет белок Cas9 прямо к вирусному геному. В дальнейшем такую молекулу стали называть направляющей РНК или РНК-гидом. А белок делает то, что он умеет — разрезает цепочку вирусной ДНК, обезвреживая вирус. Получается, что система CRISPR/Cas9 служит для бактерий аналогом иммунной системы, защищающим клетку от чужеродных проникновений.
Доказать, что система CRISPR/Cas наделяет бактерию способностью разрушать чужеродную ДНК, смогли в работе 2007 года. Ее авторы заразили бактерий Streptococcus thermophilus бактериофагом. Затем они взяли тех бактерий, что оказались устойчивыми к инфекции, и проанализировали их CRISPR-кассеты, подтвердив, что там появились новые спейсеры, соответствующие нуклеотидным последовательностям в геноме бактериофага. Если эти спейсеры удаляли из генома бактерии, устойчивость к заражению терялась. Исчезала она и в случаях, когда в геноме фага в соответствующей области накапливались мутации и РНК-гид переставал ее узнавать. Кроме того, потеря устойчивости наступала при инактивации одного из генов cas у бактерии.
Этот бактериальный механизм исследователи решили использовать в качестве инструмента для редактирования геномов. Они стали синтезировать молекулы РНК, похожие на РНК-гиды из системы CRISPR/Cas9, комплементарные тому месту в геноме, где надо сделать разрез. Полученная РНК вводится в клетки вместе с белком Cas9. РНК указывает на то место, где надо резать, а белок режет. В клетках есть собственная система починки разрывов в ДНК («репарация ДНК»). Если разрыв произошел только в одной из цепей, то разрыв в ней чинится по принципу комплементарности. Особые клеточные ферменты берут за образец уцелевшую цепь и достраивают поврежденную. Если разрыв происходит в обеих (а так и происходит, если CRISPR/Cas9 работает эффективно), то образца нет, и разрыв заполняется случайными нуклеотидами. Так можно отключить нежелательный ген.
А еще можно вместе с РНК-гидом и белком Cas9 ввести в клетку донорную ДНК, несущую нужный исследователю ген. После того, как с помощью системы CRISPR/Cas9 в нужном месте ДНК будет сделан разрыв, ферменты, ликвидирующие повреждение, воспользуются донорской ДНК в качестве образца и с определенной, довольной высокой вероятностью образуется хромосома с желаемым геном.
Бум CRISPR-редактирования начался в августе 2012 года, когда в статье Эммануэль Шарпантье, Дженнифер Дудны и их коллег в журнале Science была продемонстрирована первая такая система. В сентябре того же года группа под руководством Виргиниюса Шикшниса из Вильнюсского университета опубликовала в PNAS статью со сходными результатами. Литовская группа изначально подавала свою статью в журнал Cell, но редакция отклонила ее. Если бы не это, литовцы оказались бы первыми. В январе 2013 года свое исследование, содержавшее систему CRISPR/Cas9, опубликовал Фэн Чжан из Института Брода. Он первым испытал технологию на культурах клеток млекопитающих — мышей и людей. Вскоре еще один вариант представили Прашант Мали и Лухан Ян.
С тех пор число исследований, как использующих существующие системы CRISPR/Cas, так и вносящих усовершенствования в технологию редактирования, постоянно множится. Ранее о системе CRISPR/Cas, ее применении в терапии различных болезней и обсуждении ее перспектив мы писали в очерках «Редактирование генома: за и против» , «Новый шаг в редактировании генома», «Как бактерия распознает чужих» и в целом ряде других публикаций. Наиболее значимым достижением в этой области за последние несколько лет стало создание в 2017 году технологий, позволяющих заменить в цепочках ДНК или РНК отдельный нуклеотид. В этих технологиях использовались направляющие РНК из системы CRISPR/Cas, но белок модифицировался так, чтобы не разрезать место в цепочке, где содержится нужный нуклеотид, а только отметить его, а затем при помощи особых ферментов происходило превращение нуклеотида. Для молекул РНК такую технологию разработал уже упоминавшийся Фэн Чжан, а для ДНК — исследовательская группа Дэвида Лю.
Вокруг этого, действительно значимого открытия возникла бурная полемика, связанная с проблемой приоритета и прав на патент. Калифорнийский университет, где работали Шарпантье и Дудна, подал заявку на патентование на полгода раньше, чем Институт Брода, в котором работает Фэн Чжан. Однако Институт Брода сумел добиться ускоренного рассмотрения заявки, поэтому в 2014 году Фэн Чжан стал обладателем патента на технологию CRISPR/Cas9 в применении к эукариотическим клеткам. Это вызвало протесты со стороны Калифонийского университета, которые вылились не только в патентное разбирательство, но и в полемику в научной прессе относительно того, чей вклад в создание технологии весомее. В феврале 2017 года Совет по патентным судам и апелляциям отклонил протест Калифорнийского университета, оставив патент за Фэн Чжаном и Институтом Брода, но другая сторона не оставила попыток оспорить это решение. Датскую премию Novo Nordisk в 2017 году и Премию Кавли в 2018 году «За изобретение CRISPR-Cas9 — точного наноинструмента для редактирования ДНК, совершившего прорыв в области биологии, медицины и сельского хозяйства» получили Эммануэль Шарпантье, Дженнифер Дудна и Виргиниюс Шикшнис.
