Исследователи разработали флуоресцентные белки, свойствами которых можно управлять с помощью оранжевого и зеленого света. Эти белки помогут ученым исследовать процессы жизнедеятельности в живых клетках. Работа проходила в рамках проекта, который поддерживается грантом Российского научного фонда (РНФ), а ее результаты были опубликованы в журнале Nature Methods. Кратко о них сообщается в пресс-релизе РНФ.
Флуоресцентные белки интенсивно светятся в видимом диапазоне спектра, где длина волн составляет от 390 до 700 нанометров. Природные функции таких белков достаточно разнообразны, например, некоторые виды медуз с помощью зеленых флуоресцентных пятнышек приманивают к себе еду – различные мелкие организмы. Оптическими свойствами некоторых флуоресцентных белков – их называют фотопереключаемыми – можно управлять с помощью света. Например, эти белки можно «включать» и «выключать», что широко используется в так называемой флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения (наноскопии) – новой группе методов, позволяющих получать чрезвычайно детальные изображения внутриклеточных структур. Обычно для такой микроскопии ученые используют синее и фиолетовое облучение, которое очень токсично для клеток: оно нарушает их нормальную физиологию и даже вызывает гибель.
«Мы впервые создали фотопереключаемые флуоресцентные белки, оптические свойства которых можно контролировать зеленым и оранжевым, а не сине-фиолетовым светом. Его преимущество состоит в том, что он почти не причиняет вреда клеткам. Мы использовали новые белки для наблюдения динамики цитоскелета в живых клетках», – рассказал один из авторов статьи Александр Мишин, руководитель проекта РНФ, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Разработанный учеными белок. Источник: Александр Мишин
Для создания флуоресцентных белков ученые изменяли их (направленный и случайный мутагенез) с помощью такого метода, как полимеразная цепная реакция, которая позволяет добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов ДНК. Также ученые клонировали белки, после чего под микроскопом отбирали из полученных бактериальных колоний самые удачные. Авторы проанализировали результаты уже проведенных другими биологами экспериментов и выяснили, как приблизительно нужно изменить микроокружение хромофора (остатка ароматической аминокислоты, который отвечает за поглощение света в белке), чтобы заставить его проявить способность к фотопереключению.
Помимо ожидаемого эффекта, однако, есть и побочные, например, снижается яркость белка. Тогда случайный мутагенез позволяет найти дополнительные мутации, компенсирующие побочные эффекты при сохранении целевого.
Разработанные белки называются репортерными, так как выполняют роль «шпионов» в клетках. Их присоединяют к другим белкам и таким образом следят за ними в живой клетке. Полученная детальная информация может быть использована как в фундаментальных, так и в биомедицинских исследованиях. Например, у больного раком пациента опухолевые клетки демонстрируют сильные нарушения клеточной подвижности и динамических перестроек цитоскелета – каркаса, находящегося в цитоплазме живой клетки. При этом изучение этих процессов со сверхвысоким разрешением (наноскопия) затруднено в живых клетках из-за слишком интенсивного облучения образца, поэтому для таких целей нужно использовать методы с меньшей токсичностью для организма.
Авторы использовали свою разработку для микроскопии сверхвысокого разрешения RESOLFT. У полученных белков есть особенность: у них очень эффективное фотопереключение, то есть белки «включаются» и «выключаются» за миллисекунды. Такое свойство подходит не всем методам микроскопии, в некоторых такая скорость будет только мешать. В RESOLFT цикл включения-выключения повторяется многократно для соседних точек, сканируемых лазерными пучками. Чем лучше флуоресцентная метка переключается, тем быстрее удается снять полное изображение, так как на фотопереключение в каждой точке нужно меньше времени. «Созданные нами флуоресцентные белки позволяют проводить сверхразрешающую микроскопию без вреда для живой клетки, что открывает возможность исследования динамических процессов в ней», – заключил ученый.
Работа проходила в сотрудничестве с учеными из Королевского технологического института (Швеция) и Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна (США).
