Ученые Института биологии гена РАН создали трансгенных мышей, которых может заразить коронавирус SARS-CoV-2. Эксперимент подтвердил, что мыши заболевают COVID-19 и, соответственно, могут быть использованы в качестве безопасного инструмента для поиска лекарств и создания вакцин от коронавирусной инфекции.
Разработку средств борьбы с COVID-19 значительно затрудняет то, что у ученых нет подходящих для этой цели лабораторных животных. Зафиксированы случаи заражения вирусом кошек, собак, хорьков, летучих мышей, обезьян, норок, пум, снежных барсов, тигров и землероек. Клиническая картина у норок и хорьков значительно отличается от проявлений болезни у людей, у них чаще всего проявляется желудочно-кишечный тип болезни. Собак и кошек, а также обезьян невозможно использовать массово, а без этого нельзя выявить, например, редкие варианты течения болезни или побочные эффекты вакцин. Наиболее удобным вариантом были бы традиционные лабораторные животные — крысы или мыши, но они не подвержены инфекции.
«Мыши — очень удобные животные для лабораторных исследований. И не только потому, что они мало едят (примерно шесть граммов корма в день) и быстро размножаются (беременность длится 21 день, половое созревание наступает примерно в месяц). Дело в том, что мыши изучены вдоль и поперек. Изучены особенности иммунного ответа, изучены распределения лекарств в тканях, добуквенно прочитан геном, известна роль конкретных полиморфизмов. Можно даже выбрать мышиную линию с определенными свойствами (с иммунодефицитом, с ожирением и т. п.). Благодаря тому, что выведены чистые линии, контрольная группа всегда окажется контрольной», — объясняет один из авторов исследования Александра Брутер, сотрудник Института биологии гена РАН.
Если таких животных нет, их надо создать. Для этого нужно снабдить мышей специфическими белками, которые необходимы вирусу SARS-CoV-2, чтобы атаковать организм. Как известно, вирус, чтобы проникнуть в клетку человека, использует рецептор-связывающий домен (RBD) гликопротеина, составляющего «шипы», на белковой оболочке вируса. Этот домен RBD соединяется с белком ACE2 на клеточной мембране. Следовательно, чтобы мыши заражались коронавирусной инфекцией, в мембранах их клеток тоже должен присутствовать белок ACE2. У мышей есть свой мембранный белок ACE2 (он обозначается mACE2, а белок человека — hACE2), но мышиный белок недостаточно похож на человеческий, чтобы вирус мог проникнуть в клетку с его помощью.
В проникновении вируса играет роль еще один человеческий белок — трансмембранная сериновая протеаза 2 (TMPRSS2). Этот белок вступает во взаимодействие с «шипами» коронавируса и изменяет их таким образом, что они лучше связываются с ACE2. Поэтому исследователи решили наделить своих трансгенных мышей сразу двумя белками: и hACE2, и TMPRSS2.
Но «научить» мышей болеть COVID-19 недостаточно. Нужно еще сделать так, чтобы с такими мышами можно было работать. Восприимчивые к коронавирусу мыши станут заражаться болезнью от работающих с ним людей, заражать друг друга и умирать целыми вивариями. Поэтому хотелось бы иметь возможность включать и выключать мышиную восприимчивость.
Чтобы добиться этого, ученые использовали вирусный белок Cre-рекомбиназу. Белок этот умеет узнавать определенные последовательности ДНК (так называемые LoxP-сайты), вырезать фрагмент ДНК между двумя LoxP-сайтами и сшивать цепочку ДНК вновь без вырезанного фрагмента. Ген hACE2 вставлялся в мышиный геном в модифицированном виде. У каждого гена имеется промотор — участок ДНК, служащий сигналом для фермента РНК-полимеразы, что пора приступать к синтезу РНК (потом эта РНК поступает в рибосомы, где синтезируется соответствующий белок). Но между промотором и остальной частью гена можно расположить определенную последовательность нуклеотидов, которая будет непроходимой для РНК-полимеразы, тогда синтез РНК и в дальнейшем белка с этого гена будет невозможен. Такая последовательность называется STOP-кассетой.
Если же с обеих сторон STOP-кассеты вставить LoxP-сайты, а мышей снабдить Cre-рекомбиназой, то Cre-рекомбиназа будет по команде вырезать из ДНК STOP-кассету и запускать синтез нужного белка. Мыши получат человеческий ген ACE2 в нужный момент, а до этого заражаться коронавирусом не будут. Сигналом для Cre-рекомбиназы служит препарат тамоксифен. Он дается мышам с кормом в течение определенного времени. Молекулы тамоксифена попадают в клетки, где соединяются с Cre-рекомбиназой. После этого рекомбиназа получает способность проникнуть в клеточное ядро и делает свое дело — вырезает STOP-кассету. И коронавирус после этого может заразить мышь.
Для проверки действия Cre-рекомбиназы к гену ACE2 был присоединен ген флуоресцентного белка. После добавления в корм тамоксифена STOP-кассета была вырезана, гены заработали и мыши стали светиться в ультрафиолетовом свете.
Использование Cre-рекомбиназ в последние десятилетия стало популярным методом в молекулярной биологии, позволяющим в нужный момент включать или выключать какой-нибудь ген. Более того, различные модификации этих рекомбиназ позволяют сделать так, чтобы ген включался в определенном типе тканей, например, только в клетках легких. Генетически модифицированные мыши, снабженные геном Cre-рекомбиназы, уже существовали, так что авторам исследования нужно было воспользоваться такими готовыми мышами и скрестить их с мышами, в геном которых введены человеческие гены ACE2 и TMPRSS2.
«Важное свойство этих мышей — безопасность, — объясняет Александра Брутер. — Восприимчивыми к коронавирусу они становятся только после активации. До того их можно содержать в обычном виварии, размножать, перевозить с места на место и не бояться, что они заразятся от сотрудников. Благодаря универсальности STOP-кассеты активировать экспрессию hACE2 можно в любом возрасте в любой ткани. Возможно, благодаря этому удастся выяснить причины более тяжелого течения болезни у пожилых и особенности формирования иммунитета у людей разных возрастов».
Концепция восприимчивых к коронавирусу трансгенных мышей, у которых экспрессия гена ACE2 зависит от Cre-рекомбиназы, была предложена учеными Института биологии гена в статье, вышедшей в мае прошлого года. Теперь в журнале Transgenic Research они опубликовали новую статью, где сообщили об успешном получении мышей с человеческим геном ACE2. На подходе мыши с человеческим геном TMPRSS2, а затем и мыши с генами обоих этих белков. Уже полученные трансгенные мыши были перевезены из Института биологии гена в лабораторию научного центра «Вектор» под Новосибирском, где их действительно удалось заразить коронавирусом и наблюдать характерные симптомы болезни. Сейчас эти мыши служат тест-системой для испытания новых вакцин от COVID-19.
