На этой неделе публикации в журналах Science и Nature представили два новых метода редактирования генома. Один из них относится к редактированию молекул ДНК, другой же впервые применен к молекулам РНК. Оба метода открывают новые возможности как для генетических исследований, так и для лечения болезней.
Наиболее мощный из существующих методов редактирования генома – CRISPR/Cas9, о котором мы неоднократно рассказывали ранее, создан на основе примитивной “иммунной системы” бактерий. Напомним кратко, что CRISPR означает «Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats» – короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами. Такое название изначально получили короткие последовательности бактериальной ДНК, соответствующие фрагментом из ДНК поражающих бактерию вирусов. С этих последовательностей бактерия синтезирует цепочки РНК. РНК взаимодействует по принципу комплементарности с ДНК новых вирусов, проникающих в бактериальную клетку, а пока они взаимодействуют, специальный белок Cas9 разрезает вирусную ДНК в месте взаимодействия, уничтожая вирус.
Биологи научились использовать этот метод для изменения ДНК не вирусов, а любых клеток. Они стали синтезировать молекулы РНК похожие на РНК из системы CRISPR/Cas9, комплементарные тому месту в геноме, где надо сделать разрез. Полученная РАН вводится в клетки вместе с белком Cas9. РНК указывает на то место, где надо резать, а белок – режет. Внесение разрыва в двухцепочечную геномную ДНК сильно повышает вероятность гомологической рекомбинации – процесса, при котором гомологичные хромосомы могут обмениваться гомологичными фрагментами. Если ввести в клетку донорную ДНК, несущую нужный исследователю ген, а затем с помощью системы CRISPR/Cas9 ввести разрыв в нужное место, то с определенной довольной высокой вероятностью образуется хромосома с желаемым геном.
Новые методы не связаны с разрезанием молекулярной цепочки и вставкой в нее нового фрагмента. В них используются ферменты, которые позволяют перегруппировать атомы в азотистых основаниях, входящих в состав ДНК или РНК, превратив их в другие основания. Напомним, что генетическая информация в ДНК или РНК записывается при помощи нуклеотидов, состоящих из сахара – дезоксирибозы (в РНК – рибозы) и одного из четырех азотистых оснований: аденина, гуанина, цитозина и тимина (в РНК вместо тимина используется урацил). Нуклеотиды соединяются друг с другом в пары при помощи водородной химической связи, причем аденин всегда соединяется с тимином (урацилом), а гуанин с цитозином – в этом состоит принцип комплиментарности. Последовательность этих пар в молекулярной цепочке и служит генетическим кодом. Когда двойная спираль разъединяется, например, при делении клетки, ее вторая часть достраивается по принципу комплиментарности.
Если ставший уже классическим метод CRISPR/Cas9 можно сравнить с хирургическим удалением части “органа” и последующей трансплантацией, то новые способы мы можем сопоставить, скорее, с пластической хирургией, когда весь эффект достигается за счет минимального вмешательства. Внеся столь небольшое изменение в цепочку ДНК, мы можем справиться с целым рядом генетических болезней, ведь нередко различие между нормальным геном и его неработающим вариантом составляет только один нуклеотид. Метод изменения нуклеотидов в ДНК создала команда под руководством Дэвида Лю (David Liu), а метод редактирования РНК – коллектив, который возглавляет Фэн Чжан (Feng Zhang). Оба метода не заменяют систему CRISPR/Cas9, а служат полезным дополнением к ней.
При редактировании нуклеотидов используются заимствованные из метода CRISPR/Cas9 направляющие РНК, которые указывают нужное место генома, но вместо белка Cas9 используется его модифицированный вариант, который может найти нужное место в цепочке, но не разрезает его. Затем в дело вступают ферменты, способные превратить цитозин в тимин, а аденин в гуанин. Обратных превращений добиться труднее, так как необходимых для них природных ферментов не существует. В результате это препятствие обошли поэтапно: сначала стали превращать аденин в иноцин, который потом превращался в гуанин. После этого замена тимина на цитозин происходила “сама собой”, то есть в действие вступали механизмы репарации ДНК, которые обнаруживали и исправляли нарушение принципа комплиментарности.
Уметь редактировать не только ДНК, но и РНК важно потому, что РНК помимо переноса генетической информации из клеточного ядра в рибосомы играет также важную роль в регуляции работы генов. К тому же, воздействие на РНК кажется части исследователей более безопасным, поскольку, если при редактировании вдруг по каким-либо причинам окажется измененной фрагмент ДНК, который никто менять не собирался, это изменение останется в геноме, а если мы редактируем короткоживущую молекулу РНК, последствия такой ошибки будут лишь временными.
